长链非编码RNABANCR在肝细胞癌组织中表达上调及其对患者疾病预后价值探讨

赵 冀，周 超，李宏敏，杨洪吉

(四川省人民医院：1.器官移植中心；2.消化内科；3.肿瘤科，成都 610000)

长链非编码RNABANCR在肝细胞癌组织中表达上调及其对患者疾病预后价值探讨

赵 冀1，周 超2，李宏敏3，杨洪吉1

(四川省人民医院：1.器官移植中心；2.消化内科；3.肿瘤科，成都 610000)

目的 探讨BRAF激活的长链非编码RNA(BANCR)在肝细胞癌(HCC)组织中表达上调及其对患者疾病预后价值。方法 采用实时定量PCR检测HCC组织和细胞系中BANCR表达情况，分析BANCR表达水平与患者临床病理学特征关系，采用四甲基噻唑蓝(MTT)、流式分析和肿瘤细胞体外侵入迁移分析探讨BANCR在HCC细胞中的生物学功能。结果 与临近非肿瘤组织相比，HCC组织标本中BANCR表达水平明显上调(P<0.01)，且HCC细胞系中BANCR表达水平也明显上调(P<0.05)。临床病理学特征分析结果提示BANCR表达升高与较高的肿瘤分级、肿瘤直径、静脉侵入及较高的TNM分期密切相关(P<0.05)。BANCR过表达HCC患者总生存期明显短于低表达患者(P<0.01)。多重变量Cox回归分析提示BANCR表达(RR=4.245，P=0.015)、肿瘤直径(RR=2.655，P=0.039)、静脉侵入(RR=3.278，P=0.022)和TNM分期(RR=6.379，P=0.006)是HCC患者总生存期独立预后因素。此外，Hep3B细胞中BANCR表达下调能明显抑制细胞侵入和转移，同时导致波形蛋白下调和E-钙黏蛋白上调。结论 本研究结果表明BANCR可能参与HCC的发生和发展过程，可以作为HCC患者疾病预后标志物和临床治疗靶标。

RNA；肝肿瘤；癌，肝细胞；长链非编码RNA，BANCR；预后

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在全球常见肿瘤中排第5，其发病率呈逐年上升趋势，在中国也是如此[1]。尽管临床和实验肿瘤学不断取得进展，但由于患者大多在肿瘤晚期确诊，缺乏有效治疗和介入方法，因此临床长期预后较差。早期研究揭示了多种与HCC相关的调节基因和信号通路[2-3]，然而HCC发生和发展潜在的高度复杂的分子机制目前仍所知甚少。因此，临床急需一种HCC早期诊断，有效治疗和预后的分子标志物。BRAF激活的非编码RNA(BANCR)为693 bp的长链非编码RNA(lncRNA)，由Flockhart等[4]在黑色素瘤细胞中发现。随后，甲状腺乳头状癌[5]、视网膜母细胞癌[6]、肺癌[7-8]、胃癌和结直肠癌[9]中均发现lncRNA BANCR表达异常。上述肿瘤中BANCR均参与肿瘤细胞增殖、迁移和侵入，然而其在HCC中表达的研究较少。本研究检测BANCR在HCC组织和细胞系中的表达，同时分析其表达与HCC患者临床病理学特征的关系，此外，本研究还初步探讨了BANCR对HCC细胞的调节作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 HCC组织和相应临近非肿瘤组织均采集于2009～2011年本院治疗的109例HCC患者，均在术中采集并置于液氮中保存。所有患者均为原发病例，患者临床病理学特征从病历中获取，入组前均未接受任何治疗，并将所取组织分为HCC组织组和非肿瘤组织组。本研究通过本院伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与RNA干扰 HCC细胞系(HuH-7，Hep3B，HepG2和H2-M)及健康人肝细胞CL-48均购自ATCC(美国)，采用高糖(4.5 g/L)DMEM培养基，培养条件为5% CO237 ℃。青、链霉素终浓度为100 U/mL，此外还添加10%胎牛血清。lncRNA BANCR干扰RNA(si-BANCR)和对照干扰RNA(siRNA)均购自Sigma-Aldrich公司，采用Lipofectamine 2000进行转染，48 h收集细胞。

1.2.2 RNA提取和实时定量PCR检测 组织miRNA采用mirVana miRNA提取试剂盒(AB公司，美国)提取，通过SPECTRAmax微孔板紫外分光光度计(Molecular devices corp，美国)测定微RNA(miRNA)浓度，参考文献[6]合成BANCR和内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)扩增引物。通过2-ΔΔCt方法，根据内参含量计算miRNA-21的相对表达水平。

1.2.3 细胞增殖、凋亡分析 采用四甲基噻唑蓝(MTT)方法进行细胞增殖分析，步骤如下：铺96孔板，每孔细胞1×103，连续培养。两组都加入20 μL MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后移去上清液，DMSO每孔150 μL，测定光密度(OD) 490 nm值。转染48 h后，收集细胞，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、重旋后，采用碘化丙啶(10 μg/mL)和钙磷脂结合蛋白Ⅴ(50 μg/mL)处理细胞，黑暗环境下室温孵育15 min后，进行流式分析。

1.2.4 细胞侵入和转移分析 采用6孔transwell小室(直径8 μm)进行肿瘤细胞的侵入和转移分析，进行转移分析时，将转染后的1×105的HCC细胞加入不含血清培养基的上室中，下室为含20%胎牛血清的全培养基，刺激细胞转移，孵育48 h，取出下室置于95%的乙醇中，固定 10 min，0.1%的结晶紫染色20 min，显微计数。进行肿瘤细胞侵入分析时，上室中加入5 mg/mL的基质胶，其他步骤与转移分析相同。

1.2.5 Western blot分析 采用含蛋白酶的RIPA溶液裂解细胞，并抑制内源性磷酸酶活性，采用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳后转印蛋白至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，常规封闭后，孵育一抗(Cell signal，美国)，之后采用H辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗进行孵育，加入电化学发光(ECL)Plus进行发光， GAPDH作为内参蛋白。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件处理，BANCR表达水平与其他因素的相关性采用卡方检验和Fisher′s精准检验或独立t检验。采用Kaplan-Meier方法计算患者生存期，根据术后随访结果计算患者总生存期。组间生存期比较则采用秩和检验，对于单一变量检测影响HCC患者总生存期的显著性因素进行多重变量分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HCC组织和细胞系中BANCR表达检测 采用实时定量PCR检测HCC组织和细胞系中BANCR表达水平。与临近非肿瘤组织相比，HCC组织中BANCR表达显著上调(P<0.01)，且4株HCC细胞系中BANCR表达也显著上调(P<0.05)，见图1。其中Hep3B细胞系中BANCR表达升高水平高于其他3株细胞，因此选择其进行后续体外实验。

A:HCC组织和临近非肿瘤组织BANCR表达检测；B:4株HCC细胞系中BANCR表达检测。

图1 HCC组织和细胞系中BANCR表达实时定量PCR检测

2.2 BANCR表达与HCC患者临床病理学特征关系分析 本研究进一步探讨BANCR表达与HCC患者临床病理学特征关系，根据109例患者HCC组织标本BANCR表达检测的平均值将其分成低表达组(55例)和高表达组(54例)。结果表明BANCR表达与较高肿瘤分级(P=0.007)、较大肿瘤直径(P=0.003)、静脉侵入(P=0.001)和较高的TNM分期(P=0.002)密切相关，而与患者的年龄、性别、肝硬化、血清AFP水平和实体瘤数量无关，见表1。

2.3 BANCR表达与HCC患者疾病预后 为探讨BANCR表达升高对HCC患者总生存期预后的价值，本研究采用Kaplan-Meier方法和秩和检验进行统计分析，结果提示BANCR过表达HCC患者总生存期显著短于低表达患者(P<0.01)，见图2。此外，仅在较小肿瘤直径(P=0.025)、分化良好肿瘤(P=0.037)、静脉侵入阴性(P=0.008)和TNM早期(P<0.01)患者中观察到生存效益，见表2。多重变量Cox回归分析提示BANCR表达(RR=4.245，P=0.015)、肿瘤直径(RR=2.655，P=0.039)、静脉侵入(RR=3.278，P=0.022)和TNM分期(RR=6.379，P=0.006)是HCC患者总生存期独立预后因素。

表1 BANCR表达与HCC患者临床病理学特征关系分析

续表1 BANCR表达与HCC患者临床病理学特征关系分析

图2 HCC患者BANCR表达的Kaplan-Meier分析

相关因素单一变量分析RRP多重变量分析RRP性别0.7210.455--年龄0.7850.323--肿瘤直径3.2520.0252.6550.039实体瘤数量0.8680.156--血清AFP0.8160.194--肝硬化0.9040.092--肿瘤分级2.3870.0370.7950.146TNM分期6.225<0.016.3790.006静脉侵入5.1530.0083.2780.022BANCR表达5.983<0.014.2450.015

-:无数据。

2.4 BANCR表达下调对Hep3B细胞生物学行为影响 本研究进一步探讨BANCR表达下调对Hep3B细胞生物学行为影响，采用si-BANCR转染Hep3B细胞。与对照组(Si-NC)相比，BANCR表达下调能显著抑制Hep3B细胞增殖，并能促进细胞凋亡。此外，Hep3B细胞的侵入和转移能力也显著下降，见图3。

2.5 BANCR介导的EMT表型分析 Western blot提示BANCR下调导致波形蛋白(Vimentin)表达下调和E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达上调，见图4。

A:BANCR表达水平实时定量PCR检测；B:Hep3B细胞MTT分析；C:Hep3B细胞流式分析；D、E:Hep3B细胞肿瘤细胞体外侵入迁移分析。

图3 BANCR表达下调对Hep3B细胞生物学行为影响分析

图4 Western blot方法检测波形蛋白和E-cadherin表达情况

3 讨 论

对调节HCC形成和发展的新型分子进行鉴定有利于疾病的预防，并对其诊断和治疗具有重要意义，lncRNAs与肿瘤之间的关系成为当前肿瘤研究的热点领域，目前研究报道了几种HCC组织中表达异常的lncRNAs，例如HCC细胞系中lncRNA AOC4P过表达可以通过抑制内皮细胞间质化(EMT)，进而抑制细胞增生、迁移和侵入[10-11]。lncRNA UCA1在HCC组织中表达异常升高，且与患者TNM分期、转移和术后生存期密切相关[12]，体内/体外敲除UCA1后HCC细胞生长均受到抑制。血清lncRNA-AF085935可以用于鉴别诊断非乙型肝炎病毒(HBV)感染的HCC患者和HBV感染的HCC患者[13]。负荷HCC肿瘤小鼠注射lncRNA PTENP1表达质粒后能有效控制肿瘤生长，抑制瘤内细胞增殖、引发凋亡、自噬和抑制肿瘤的血管生成[14]。上述研究表明lncRNAs在HCC的发生和发展中发挥重要作用，且具备较好的临床运用潜力。

本研究中结果表明HCC组织和细胞系中BANCR表达明显升高，提示BANCR过表达与HCC的发生密切相关。其次，BANCR表达增加与患者HCC的侵袭性临床病理学特征相关。下调BANCR 在Hep3B细胞中表达水平能降低细胞增生，促进细胞凋亡和减弱细胞侵袭和转移。这些发现提示BANCR可能参与HCC发展，可能作为肿瘤治疗的靶分子。最后，本研究发现BANCR高表达的HCC患者的总生存期显著短于低表达患者。多重变量Cox回归分析表明，BANCR过表达是HCC患者疾病预后不良的独立因素。

研究报道表明BANCR是多种人类肿瘤的癌基因，BANCR在人类恶性黑色素瘤组织中表达增加与肿瘤晚期相关，且敲除BANCR可以通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径抑制黑色素瘤细胞增殖和迁移[4,15]。在结直肠癌中BANCR过表达与患者肿瘤分期和淋巴结转移密切相关，且可以通过EMT机制促进肿瘤细胞转移。与临床非肿瘤组织相比，胃癌组织中BANCR表达显著升高，且BANCR表达水平与胃癌患者临床分期、肿瘤深度、淋巴结转移、远处转移和预后不良呈正相关[9]。体外研究表明，BANCR可以调节视网膜母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵入，且BANCR过表达与肿瘤直径、脉络膜侵入和视神经侵入密切相关[6]。

EMT是原位肿瘤细胞获得迁移能力的关键步骤[16]，Vimentin上调和E-cadherin下调与HCC发展相关[17-18]，越来越多研究证实lncRNAs，包括BANCR，可能参与EMT途径的调节[10,11,19,20]。本研究中BANCR表达下调后导致Vimentin下调和E-cadherin上调，提示BANCR可能参与HCC的EMT调节，进而为BANCR相关的细胞高转移倾向提供了合理的解释。

总之，本研究证实HCC组织和细胞系中BANCR表达上调，且其过表达与肿瘤发展和预后不良密切相关，调控HCC细胞系中BANCR表达会影响细胞的生物学特性。上述结果提示BANCR可能是参与HCC发生和发展的癌基因，可以作为HCC预后的新型标志物和潜在的治疗靶分子。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]Cartularo L,Laulicht F,Sun H,et al.Gene expression and pathway analysis of human hepatocellular carcinoma cells treated with Cadmium[J].Toxicol Appl Pharmacol,2015,288(3):399-408.

[3]Li QF,Li QY,Gao AR,et al.Correlation between promoter methylation in the GSTP1 gene and hepatocellular carcinoma development:a meta-analysis[J].Genet Mol Res,2015,14(2):6762-6772.

[4]Flockhart RJ,Webster DE,Qu K,et al.BRAFV600E remodels the melanocyte transcriptome and induces BANCR to regulate melanoma cell migration[J].Genome Res,2012,22(6):1006-1014.

[5]Wang Y,Guo Q,Zhao Y,et al.BRAF-activated long non-coding RNA contributes to cell proliferation and activates autophagy in papillary thyroid carcinoma[J].Oncol Lett,2014,8(5):1947-1952.

[6]Su S,Gao J,Wang T,et al.Long non-coding RNA BANCR regulates growth and metastasis and is associated with poor prognosis in retinoblastoma[J].Tumour Biol,2015,36(9):7205-7211.

[7]Sun M,Liu XH,Wang KM,et al.Downregulation of BRAF activated non-coding RNA is associated with poor prognosis for non-small cell lung cancer and promotes metastasis by affecting epithelial-mesenchymal transition[J].Mol Cancer,2014(13):68.

[8]Jiang W,Zhang D,Xu B,et al.Long non-coding RNA BANCR promotes proliferation and migration of lung carcinoma via MAPK pathways[J].Biomed Pharmacother,2015(69):90-95.

[9]Li L,Zhang L,Zhang Y,et al.Increased expression of LncRNA BANCR isassociated with clinical progression and poor prognosis in gastric cancer[J].Biomed Pharmacother,2015(72):109-112.

[10]Guo Q,Zhao Y,Chen J,et al.BRAF-activated long non-coding RNA contributes to colorectal cancer migration by inducing epithelial-mesenchymal transition[J].Oncol Lett,2014,8(2):869-875.

[11]Wang TH,Lin YS,Chen Y,et al.Long non-coding RNA AOC4P suppresses hepatocellular carcinoma metastasis by enhancing vimentin degradation and inhibiting epithelial-mesenchymal transition[J].Oncotarget,2015,6(27):23342-23357.

[12]Wang F,Ying HQ,He BS,et al.Upregulated lncRNA-UCA1 contributes to progression of hepatocellular carcinoma through inhibition of miR-216b and activation of FGFR1/ERK signaling pathway[J].Oncotarget,2015,6(10):7899-7917.

[13]Lu J,Xie F,Geng L,et al.Investigation of serum lncRNA-uc003wbd and lncRNA-AF085935 expression profile in patients with hepatocellular carcinoma and HBV[J].Tumour Biol,2015,36(5):3231-3236.

[14]Chen CL,Tseng YW,Wu JC,et al.Suppression of hepatocellular carcinoma by baculovirus-mediated expression of long non-coding RNA PTENP1 and microRNA regulation[J].Biomaterials,2015(44):71-81.

[15]Li R,Zhang L,Jia L,et al.Long non-coding RNA BANCR promotes proliferation in malignant melanoma by regulating MAPK pathway activation[J].PLoS One,2014,9(6):e100893.

[16]Thiery JP,Acloque H,Huang RY,et al.Epithelial-Mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell,2009,139(5):871-890.

[17]Chen J,Zhao J,Ma R,et al.Prognostic significance of E-cadherin expression in hepatocellular carcinoma:a meta-analysis[J].PLoS One,2014,9(8):e103952.

[18]Hu L,Lau SH,Tzang CH,et al.Association of vimentin overexpression and hepatocellular carcinoma metastasis[J].Oncogene,2004,23(1):298-302.

[19]Wu ZH,Wang XL,Tang HM,et al.Long non-coding RNA HOTAIR is a powerful predictor of metastasis and poor prognosis and is associated with epithelial-mesenchymal transition in colon cancer[J].Oncol Rep,2014,32(1):395-402.

[20]Zhou X,Liu S,Cai G,et al.Long non coding RNAMALAT1 promotes tumor growth and metastasis by inducing epithelial mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma[J].Sci Rep,2015:15972.

Expression up-regulation of lncRNA BANCR in hepatocellular carcinoma tissue and its prognostic value on patients′ disease

ZhaoJi1，ZhouChao2，LiHongmin3，YangHongji1

(1.OrganTransplantationCenter;2.DepartmentofGastroenterology;3.DepartmentofOncology,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610000,China)

Objective To investigate the expression up-regulation of BRAF activated LncRNA(BANCR) in hepatocellular carcinoma(HCC) tissue and its prognostic value on patients′ disease.Methods The quantitative real-time PCR(qRT-PCR) was used to detect BANCR expression in HCC tissues and cell lines.The association between BANCR expression level and clinicopathological features was also analyzed.3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT),flow cytometry,and transwell invasion and migration assays were used to investigate the biological function of BANCR in the HCC cells.Results Compared with adjacent noncancerous tissues,BANCR expression was remarkably increased in HCC tissue sample (P< 0.01),moreover BANCR expression in HCC cell lines was also significantly up-regulated (P<0.05).The clinicopathologic features analysis revealed that the BANCR expression increase was closely correlated with higher tumor grade,tumor size,venous infiltration and higher TNM staging(P<0.05).The total survival period in HCC patients with BANCR overexpression was significantly shorter than that in the patients with BANCR low expression (P<0.01).The multi-variate Cox regression analysis indicated that the BANCR expression(RR=4.245，P=0.015),tumor diameter(RR=2.655，P=0.039),venous invasion(RR=3.278，P=0.022) and TNM staging(RR=6.379，P=0.006) were the independent prognostic factor of the total survival period in the HCC patients.Moreover,BANCR expression down-regulation in Hep3B cells could significantly inhibit the cellular invasion and transfer,meanwhile led to vimentin down-regulation and E-cadherin up-regulation.Conclusion This research results suggest that BANCR may contribute to HCC initiation and development process and would be used as a marker of the prognosis in HCC patients as well as a therapeutic target.

RNA；liver neoplasms;hepatocellular carcinoma;long non-coding RNA,BANCR;prognosis

赵冀(1980-)，主治医师，博士，主要从事器官移植、肝癌方面研究。

� 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.002

R

A

1671-8348(2017)02-0148-04

2016-07-20

2016-09-09)