维生素C联合硼替佐米对人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞凋亡的应用*

邢宏运,卞铁荣，2，邓 宇

(1.西南医科大学附属医院血液内科，四川泸州 646000；2.西安理工大学材料学院，西安 710048；3.重庆医科大学临床2系，重庆 400016)

维生素C联合硼替佐米对人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞凋亡的应用*

邢宏运1,卞铁荣1，2，邓 宇3

(1.西南医科大学附属医院血液内科，四川泸州 646000；2.西安理工大学材料学院，西安 710048；3.重庆医科大学临床2系，重庆 400016)

目的 研究维生素C联合硼替佐米对人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)与Bcl-2相关X蛋白(Bax) 表达调节的影响。方法 采用30 nmol/L的硼替佐米组，100 μg/mL的维生素C组及联合组分别作用于Jurkat细胞24、48、72 h，设立未加药物的对照组，应用倒置显微镜观察细胞的生长方式，免疫组织化学检测Bax及Bcl-2的表达，CCK-8及流式细胞技术检测Jurkat细胞凋亡率和细胞周期。结果 维生素C使Jurkat细胞的生长方式从对照组的局部聚集向近乎均匀分散变化；维C组及联合组在24 h至48 h期间，Bcl-2的表达降低较硼替佐米组快，Bax表达升高的亦快，且维C组24～48 h对Bax的表达增量远超过硼替佐米组。CCK-8检测发现，在72 h时维C组、联合组、硼替佐米组Jurkat细胞的抑制率分别为25.72%、75.23%、56.81%；流式检测凋亡率在72 h分别为81.73%、67.06%与81.50%；维生素C组的早期凋亡率大于晚期凋亡率，而硼替佐米组与联合组均为早期凋亡率低，但维生素C的添加，联合用药组细胞的早期凋亡率得到了大约15.26%的提高。结论 维生素C抑制T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞的增殖，尤其是促进Jurkat细胞早期凋亡，且细胞凋亡调控蛋白Bax与Bcl-2参与了维生素C诱导Jurkat细胞凋亡机制。

Jurkat细胞；淋巴瘤，T细胞；细胞凋亡；抗坏血酸；凋亡调控蛋白

近年来,人们认识到维生素C在心血管系统疾病及癌症预防和治疗中可能发挥重要作用[1-8]。而硼替佐米对T细胞淋巴瘤细胞的凋亡、增殖等方面研究颇多[9-11]，且人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞在国内外已经广泛地用于白血病的研究，而药物诱导细胞凋亡疗法已经成为治疗白血病的主要途径。本课题组用Jurkat 细胞为靶细胞,观察维生素C、硼替佐米、维生素C联合硼替佐米(简称联合组)分别对人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞凋亡的差异，同时研究凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax) 和细胞周期、细胞凋亡的变化，探讨维生素C能否成为治疗或预防癌症的常规辅助药物，为临床治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 硼替佐米(西安杨森制药有限公司)，维生素C注射液(上海现代哈森药业有限公司)，AnnexinV-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒(美国BD公司)，细胞周期试剂盒(上海凯基生物)，CCK-8(日本Dojindo公司)，Bax、Bcl-2 单克隆抗体(美国cell signaling公司)，Jurkat 细胞(中科院上海细胞库)，DMEM 培养液(美国Gibco公司)，96 孔和6孔培养板(美国Thermo Nunc公司)，胎牛血清(新西兰PAA公司)，流式细胞仪(德国Beckman Coulter Epcis-XL公司)，全波长分光光度计(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及细胞生长方式观察 实验组分别为30 nmol/L的硼替佐米组，100 μg/mL的维生素C组(后简称维C组)及联合组(两种药物的浓度不变)，分别作用于Jurkat细胞24、48、72 h；对照组未加药物。观察比较各组细胞的生长方式。

1.2.2 药物对细胞的增殖抑制实验 制备Jurkat细胞悬液，将细胞调整浓度为1×108/L，接种于96孔培养板上，每孔100 μL。37 ℃培养箱中培养24 h后，分别加入30 nmol/L的硼替佐米，100 μg/mL的维生素C及联合组药物，作用24、48、72 h。检测前加入10 μL的CCK-8，然后培养1～4 h，通过全波长分光光度计测定450 nm波长的吸光度值(A值)。实验设置复孔，抑制率=[1-实验孔A值/对照空A值]×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 用含10%胎牛血清DMEM培养液将细胞制成细胞悬液,计数,接种于6孔板,每孔细胞数1×106,加药方法同抑制试验，37 ℃、5%CO2培养48 h,用冷磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤2次,用500 μL Binding Buffer重悬,转移到流式分析管中,加入AnnexinV-FITC 15 μL 避光反应15 min,再加入PI 5 μL避光反应5 min,立即用流式细胞仪检测。

1.2.4 流式细胞术分析细胞周期 将细胞接种于6孔板,每孔细胞数为1×106,细胞培养处理方法同上,培养48 h,收集细胞,用冷PBS 4 ℃离心洗涤2次,加入清洗液1 mL 混匀,4 ℃离心去除,加入固定液1 mL 混匀,4 ℃放置16 h,4 ℃离心去除,加入缓冲液500 μL和PI 20 μL混匀,暗室反应45 min后用流式细胞仪检测。

1.2.5 免疫法检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况 制备Jurkat细胞悬液，将细胞调整浓度为1×108/L，接种于放置盖玻片的6孔培养板上，每孔2 mL。37 ℃培养箱中培养24 h后，加药方法及培养时间同上述实验，采用一步聚合物法检测，加入1∶200 稀释的Bax、Bcl-2 单抗孵育结合,结合羊抗兔酶标二抗后应用化学染色法判定结果，采用Image-Pro Plus 中文版 6.0软件分析结果。

2 结 果

2.1 细胞生长方式 倒置荧光显微镜观察实验组和对照组24、48、72h，Jurkat细胞生长方式显示：对照组和硼替佐米组Jurkat细胞呈“堆落”生长，而维C组及联合组细胞生长方式为“堆落”散开，均匀或比较均匀地呈散细胞生长，见图1。

A：对照组；B：维C组；C：硼替佐米组；D：联合组。

图2 各组72h的流式凋亡图

A：对照组；B：维C组；C：硼替佐米组；D：联合组。

图3 各组72h细胞周期检测结果

图4 实验组Jurkat细胞内Bcl-2、Bax蛋白表达情况

组别Bcl-224h48h72hBax24h48h72h硼替佐米组211.45±0.6612.34±0.2895.42±3.1791.21±1.0496.51±2.37127.00±4.16维C组105.19±2.357.06±1.8730.44±0.734.78±0.6960.53±0.6267.94±1.65联合组268.85±17.2310.64±0.8133.76±1.78161.81±1.5184.49±2.2886.85±0.28

2.2 药物对细胞的生长抑制率 联合组、硼替佐米组及维C组对Jurkat细胞的生长抑制依次降低，CCK-8同样也验证了这一点， 3组在72h的抑制率分别为75.23%、56.81%、25.72%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 流式细胞术凋亡检测 实验组(维C组、硼体佐米组、联合组)与对照组的流式细胞术凋亡率分别为81.73%、81.50%、67.06%与28.51%，实验组较对照组细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；维C组较对照组早期凋亡率大于晚期凋亡率，其早期凋亡率占凋亡率的近60.00%，而硼替佐米组与联合组比较，早期凋亡率低，但联合组的早期凋亡率较硼替佐米组约增高15.26%，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.4 细胞周期结果 对照组G1期55.69%，S期36.31%，G2期8.00%；维C组G1期66.83%，S期31.09%，G2期0.58%；硼替佐米组G1期62.05%，S期37.95%，G2期无；联合组G1期64.01%，S期35.99%，G2期无,与对照组相比，G1期比例升高，而S期和和G2期细胞比例下降。各组间G1期和S期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)，G2期差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

2.5 实验组Bcl-2和显微镜下对各组细胞爬片染色结果 细胞染色棕黄色即阳性表达。每组选5个非重复视野，通过Image-ProPlus中文版 6.0软件分析其系列图片，蛋白表达见表1。关于Bcl-2，24h组间差异有统计学意义(P<0.05)；48h组间差异有统计学意义(P<0.05)；72h硼替佐米组与其他两组差异有统计学意义(P<0.05)，而其他两组间差异无统计学意义(P>0.05)。Bax蛋白与Bcl-2在24h相同；48h维C组与其他两组差异有统计学意义(P<0.05)，其他两组差异无统计学意义(P>0.05)；72h硼替佐米组与其他两组差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

3 讨 论

临床上硼替佐米治疗T细胞淋巴瘤价格高昂并对神经末梢细胞存在毒性,而维生素C价格低廉且是普通常见药物,且近年来维生素C在癌症的预防及治疗中作用日益受到人们重视[1]，加之其对正常细胞无不良反应，且能一定程度上提高机体的免疫力。这与文献[2-8]将维生素C应用辅助治疗卵巢癌、乳腺癌、骨转移抗放疗的患者、大剂量维生素C辅助治疗化疗晚期患者是一致的。而维生素C的作用不止表现在提高免疫力一方面，且对细胞凋亡有作用，本文对其做了研究并给出了解释。

Bcl-2是抗凋亡蛋白,在许多白血病细胞中高表达,Bax是促凋亡蛋白，其表达增加，可以导致细胞凋亡[11]。Bcl-2、Bax同为Bcl-2家族成员，Bcl-2是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一，Bax为细胞凋亡调控基因。该文实验结果表明维生素C组及联合组在24～48h时，Bcl-2的表达降低较硼替佐米组快，Bax表达升高的也快，表明维生素C在这个时间段降低了抗凋亡蛋白的表达，提高了促凋亡蛋白表达，实验结果验证了Bax水平增加与促进细胞凋亡相关，而Bcl-2蛋白水平增加与抗凋亡相关，且表明细胞凋亡可能是通过Bax这一途径实现的。但维C组及联合组48h后的作用不及硼替佐米组，这为临床建议48h后补充服用维生素C奠定基础。

在细胞增殖抑制及流式凋亡实验中维C组的抑制率近乎硼替佐米组的1/3，但维生素C的添加使细胞的早期凋亡率得到了大约15.26%的提高。细胞周期分析表明3组药物G1期细胞增加,联合组与硼替佐米组的G2和S期细胞下降,维C组与联合组的G2期和S期细胞降低，硼替佐米组S期细胞相对照组没有明显变化，G2期细胞亦明显减低，各组间G1期和S期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)，G2期差异有统计学意义(P<0.01)，但毫无疑问细胞增殖被阻滞在了G1期,使细胞无法完成DNA的复制,作用的效果与抗生素类化疗药相似。而维C组的G1期比其余两组细胞增加的高些，这是否与早期凋亡所占比例大有关，还有待于研究。总之，该研究结果表明了维生素C添加对Jurkat肿瘤细胞的早期凋亡的提高，不同于一些抑癌药物对晚期凋亡率影响大[9-10]，而早期凋亡率很小。如果维生素C对提高肿瘤细胞早期凋亡率具有普遍性，该研究就无疑为临床上应用维生素C作为肿瘤治疗的辅助药物奠定一定的基础。

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Application of vitamin C combined with bortezomib in human T cell lymphoma cell line Jurkat cell apoptosis*

XingHongyun1,BianTierong1，2,DengYu3

(1.DepartmentofHematology,AffiliatedHospital,SouthWestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.MaterialCollege,Xi′anUniversityofTechnology,Xi′an,Shaanxi710048,China;3.SecondDepartmentofClinic,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To study the influence of vitamin C combined with bortezomib on the apoptosis regulatory protein B lymphocytoma-2(Bcl-2) and Bcl-2 associated X protein (Bax) expression regulation in human T-cell lymphoma cell line Jurkat cells.Methods 30 nmol/L bortezomib group,100 μg/mL vitamin C group and the combination group were adopted to act on Jurkat cells for 24,48,72 h respectively.There was no drug added to the control group.The inverted microscope was used to observe the cell growth way.The expression of Bax and Bcl-2 proteins was detected by immunohistochemistry.CCK-8 and flow cytometry were used to detect the cellular apoptosis and cellular cycle.Results Vitamin C made the Jurkat cell growth way to change from the local accumulation growth in the control group to almost evenly disperse change.The expression decrease of Bcl-2 from 24 h to 48 h in the vitamin C group and combination group were faster than that in the bortezomib group,the Bax expression increase was also faster,moreover the expression increment of Bax from 24 h to 48 h by vitamin C far surpassed that in the bortezomib group.The inhibition rates of Jurkat cell in three groups detected by CCK-8 at 72 h were 25.72%,75.23% and 56.81% respectively.The apoptosis rates at 72 h in three groups detected by flow cytometry were 81.73%,67.06% and 81.50% respectively.Early apoptosis rate in the vitamin C group was greater than the late apoptosis rate,but the bortezomib group and combination group all had low early apoptosis rate,but cell early apoptosis rate in the combination group was increased by about 15.26% after adding vitamin C.Conclusion Vitamin C inhibits T-cell lymphoma cell line Jurkat cell proliferation,especially promotes early apoptosis of Jurkat cells,moreover confirms that the apoptosis regulatory proteins Bax and Bcl-2 participate in the vitamin C-induced Jurkat cell apoptosis mechanism.

Jurkat cells;lymphoma,T-cell；apoptosis；ascorbic acid;apoptosis regulatory proteins

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.003

四川省卫生厅项目(110349)。

邢宏运，(1974-)，副教授，博士，主要从事恶性血液病的发病机制方面研究。

R557+.4

A

1671-8348(2017)02-0152-04

2016-07-20

2016-09-02)