游离二氧化硅所致肺成纤维细胞转分化过程中DNA甲基化差异基因的MeDIP-seq检测*

侯建永，姚 武，郝长付

郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001

游离二氧化硅所致肺成纤维细胞转分化过程中DNA甲基化差异基因的MeDIP-seq检测*

侯建永，姚 武，郝长付#

郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001

#通信作者，男，1979年10月生，博士，副教授，研究方向：尘肺病的研究与防治，E-mail：haochangfu@163.com

矽肺；DNA甲基化；甲基化DNA免疫共沉淀测序

目的：检测游离二氧化硅所致肺成纤维细胞转分化过程中可能存在的DNA甲基化差异基因并探讨其可能作用机制。方法：原代培养肺成纤维细胞和肺泡巨噬细胞，建立共培养的矽肺体外模型，采用甲基化DNA免疫共沉淀测序技术检测分析不同染毒时间(0、24、48 h)的肺成纤维细胞之间的DNA甲基化差异基因，并采用DAVID工具对检测到的甲基化差异基因进行KEGG的通路富集分析。结果：共发现8 791个基因的DNA甲基化程度在3个染毒时间组中均存在差异，DAVID工具分析发现这些差异主要集中在代谢、环境信息过程、细胞过程、生物体系统、人类疾病相关通路等通路中。结论：矽肺形成过程中存在大量DNA甲基化程度发生改变的基因，且这些基因涉及多个通路。

尘肺病是由于生产过程中长期吸入生产性粉尘,粉尘在肺内潴留而引起的以肺组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病。尘肺病是职业病中所占比例最高的疾病，一直以来影响着发病者的生活质量和社会的经济发展[1]。矽肺是由于长期吸入含游离二氧化硅的粉尘引起的职业性肺疾病，通常表现为持续的炎症反应、成纤维细胞增生、过量的胶原沉积，最终导致肺间质纤维化[2]。游离二氧化硅粉尘致肺纤维化作用最强，矽肺也是尘肺病中进展最快、死亡率最高的一种。报道[3-5]显示目前国内新发尘肺病种类主要是矽肺和煤工尘肺，以采煤工、掘进工为主，其次是煤炭采掘辅助行业工人。矽肺发生机制虽尚不清楚，但是有研究[6]显示肺成纤维细胞激活后转分化为活跃的肌成纤维细胞是纤维化发生的主要变化；所谓转分化是指一种分化完全的细胞由于某些因素的作用，丢失其原有的表型特点而转变为其他类型细胞的一种特定的生理病理过程。作者所在的课题组前期研究[7]发现矽肺中肺成纤维细胞DNA甲基化程度降低，因此认为DNA甲基化改变可能是矽肺发生发展的一种调控方式，但并未进行甲基化特异性位点的探索和研究。该研究采用甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)技术对二氧化硅所致肺成纤维细胞转分化过程中可能存在的DNA甲基化差异基因进行检测，并探讨其可能的作用机制，为进一步研究其表观遗传学调控机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 实验动物：SD大鼠购自河南省实验动物中心，合格证号No.41003100002516。主要试剂：北京索莱宝有限公司的胎牛血清及高糖培养基，美国ZYMO Research公司的EZ DNA甲基化试剂盒。主要仪器:Heal Force二氧化碳培养箱、PCR扩增仪、Illumina-HiSeq 2000测序仪。

1.2 共培养模型 使用组织块法提取SD大鼠的肺成纤维细胞，培养至5～8代。采用肺泡灌洗术获得SD大鼠的肺泡巨噬细胞。参照王永星、曾鑫等[7-8]使用的共培养模型对SD大鼠的肺泡巨噬细胞和肺成纤维细胞进行共培养，构建矽肺体外模型。用100 mg/L的二氧化硅悬浊液进行染毒，分别在染毒后0 h(A1组)、24 h(A2组)、48 h(A3组)收取肺成纤维细胞备用。

1.3 DNA甲基化检测 提取各组细胞DNA并进行片段化。对片段化DNA进行末端修复后在3’端加“A碱基”，然后连接测序接头。用DNA甲基化特异抗体对连接纯化产物进行甲基化位点IP富集，IP富集产物进行PCR扩增。用20 g/L的TAE琼脂糖凝胶145 V电泳105 min，将目标区域的PCR产物切胶纯化。用2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip(Agilent公司)判断PCR产物片段大小是否符合后续测序的要求。合格的PCR产物片段用Illumina-HiSeq 2000测序仪测序。得出的数据经过处理后转化成DNA甲基化差异数据，并定义甲基化表达变化倍数在2倍以上且P<0.05者为DNA甲基化差异基因。

1.4 通路分析 利用DAVID工具对检测到的DNA甲基化差异基因进行KEGG数据库通路富集分析。

2 结果

2.1 DNA甲基化差异基因总体结果 经过数据的最初期处理和基因组定位后，共得到差异转录本71 455个，对应的惟一DNA甲基化差异基因有16 292个，其中A1与A2组间比较有13 311个，A2与A3组间比较有13 753个，A1与A3组间比较有13 417个，共有8 791个甲基化差异基因在3个组中都存在(图1)。

A1、A2、A3：分别代表A1组、A2组和A3组。图1 不同组间DNA甲基化差异基因的分析

2.2 DNA甲基化差异基因的KEGG通路分析 将共同表达的8 791个DNA甲基化差异基因录入KEGG数据库中，有2 215个基因匹配到了KEGG的通路中，以P<0.005、Benjamini<0.05为显著富集的原则[9-10]，共有5大类通路被发现，其中包括代谢、环境信息过程、细胞过程、生物体系统、人类疾病相关通路等通路。代谢通路中，嘌呤代谢集中的基因最多；环境信息过程中以MAPK信号通路集中的基因最多，其次是钙信号通路和Wnt信号通路；细胞过程相关通路中基因主要集中在了黏着斑和肌动蛋白细胞骨架调节的通路中；生物体系统中基因主要集中在轴突导向等与神经突触形成有关的通路中；人类疾病相关通路中基因大部分集中在与癌症有关的通路中。见表1。

表1 DNA甲基化差异基因的KEGG通路分析

3 讨论

以往关于游离二氧化硅所致矽肺的成纤维细胞转分化的甲基化研究多集中于单个基因的甲基化状态或者全基因组甲基化水平整体的检测，缺少全基因组中特异性甲基化位点的检测。该研究中作者通过MeDIP-seq法检测游离二氧化硅所致肺成纤维细胞转分化过程中的DNA甲基化差异基因并探讨其可能的机制，为寻找可能的干预位点和机制研究提供依据。

该研究应用成熟的细胞共培养模型对矽肺形成中的DNA甲基化进行研究，采用MeDIP-seq技术检测分析不同染毒时间(0、24、48 h)的肺成纤维细胞间的DNA甲基化差异基因，结果共发现16 292个DNA甲基化差异基因，其中有8 791个基因在3组中都存在，这说明矽肺形成的过程中可能涉及多个基因甲基化的改变，与研究[11]结果相同。

为进一步了解游离二氧化硅所致矽肺前期变化可能涉及的生物学过程和通路，探讨在此过程中可能存在的机制，作者使用DAVID工具的KEGG数据库对获得的8 791个DNA甲基化差异基因进行通路分析。KEGG(京都基因与基因组百科全书)是基因组破译方面的数据库，包括：PATHWAY、GENES/SSDB/KO和COMPOUND/GLYCAN/REACTION数据库等模块。PATHWAY数据库整合当前在分子互动网络如通路、联合体的知识，GENES/SSDB/KO数据库提供在基因组计划中出现的基因和蛋白质的相关知识，COMPOUND/GLYCAN/REACTION数据库提供生化复合物及反应方面的知识。该研究利用KEGG PATHWAY对DNA甲基化差异基因进行了通路分析，结果发现这些基因主要集中在代谢、环境信息过程、细胞过程、生物体系统、人类疾病相关通路等5个大类的通路中。

代谢通路主要集中在嘌呤、肌醇磷酸盐、脂肪酸和丙酸等的代谢过程中，以嘌呤代谢中集中的基因最多，这可能与矽肺形成中基因的甲基化和去甲基化活动过程中碳的代谢有关[12]，细胞中与碳代谢最相关的是能量的变化，由此可以推测矽肺的发生可能与成纤维细胞的能量变化有关。环境信息过程主要集中在ECM与受体相互作用、MAPK信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、ErbB信号通路、钙信号通路、ABC转运体、Wnt信号通路等信号通路中，这其中包括与细胞生长、增殖和凋亡相关的多个重要的信号通路，比如MAPK、Wnt、ErbB信号通路等，这些已经被证实在细胞的增殖和凋亡中有重要作用[13-16]，对这些通路及其中包含基因的研究可能为解释矽肺的形成机制提供思路。钙信号通路富集的基因数量仅次于MAPK通路，这说明在此过程中有大量的钙离子参与其中，这可能是矽肺形成的多个学说中“钙超载”学说的新的证据。在细胞过程通路中，主要的集中项是黏着斑、黏着连接、缝隙连接、紧密连接等与纤维化进展相关的一些过程，由此可以看出矽肺形成过程中成纤维细胞转分化后纤维化的主要形式是成纤维细胞与ECM的连接，形成黏着斑造成的。结果中还出现了轴突导向、长时程抑制、长时程增强等与神经突触形成相关的富集项，这说明成纤维细胞在转分化中发生了与突触形成相同的变化。最后的通路富集分类是人类疾病相关通路，大多数通路都是与癌症有关的通路，如结肠直肠癌、急性髓性白血病、胰腺癌、肾细胞癌、慢性髓性白血病和前列腺癌等通路，表明了矽肺的纤维化进展过程跟癌症的形成有相似的特点，比如细胞的过量增殖等，并且跟癌症有着某些通路的重叠，这说明矽肺前期有着癌症一样的生理及病理特征，如炎症等的存在[17]，对矽肺发生发展过程的研究也可能对癌症的发生发展起一定的提示作用。此次实验未对所得到的可能通路和基因进行继续深入研究以确定具体变化，下一步将对所得的通路和基因等进行功能和机制方面的深入研究。

综上所述，矽肺形成过程中存在大量DNA甲基化程度发生改变的基因，这些基因涉及多个通路，比如MAPK和Wnt等通路，可能在矽肺的形成中起到重要作用，值得进一步深入研究。

[1]THOMAS CR,KELLEY TR.A brief review of silicosis in the United States[J].Environ Health Insights,2010,4:21

[2]苏程程,向国安,马永强,等.ATP清除剂三磷酸腺苷双磷酸酶对实验性矽肺的干预作用[J].中国病理生理杂志,2016,32(5):792

[3]彭秀苗,李爱春,李新伟,等.2006至2014年济南市报告尘肺发病分析[J].中华劳动卫生职业病杂志,2016,34(3):209

[4]孙伟,耿敬东,谢峰,等.2006-2014年宁夏地区尘肺病流行病学特征[J].职业与健康,2016,32(9):1184

[5]周鹏,谢丽庄,丁帮梅.2009～2013年江苏省尘肺病新发病例状况分析[J].现代医药卫生,2014,30(22):3402

[6]SLACK JM,TOSH D.Transdifferentiation and metaplasia:switching cell types[J].Curr Opin Genet Dev,2001,11(5):581

[7]王永星,姚武,高彬,等.二氧化硅诱导大鼠肺成纤维细胞转分化中基因组甲基化水平[J].中华劳动卫生职业病杂志,2012,30(5):326

[8]曾鑫,王永星,姚武,等.细胞直接共培养模型在大鼠肺成纤维细胞转分化中的应用[J].郑州大学学报(医学版),2012,47(3):347

[9]DING H,GAO J,QIN C,et al.The dynamics of DNA methylation in maize roots under Pb stress[J].Int J Mol Sci,2014,15(12):23537

[10]HU Y,XU H,LI Z,et al.Comparison of the genome-wide DNA methylation profiles between fast-growing and slow-growing broilers[J].PLoS One,2013,8(2):e56411

[11]UMEMURA S,FUJIMOTO N,HIRAKI A,et al.Aberrant promoter hypermethylation in serum DNA from patients with silicosis[J].Carcinogenesis,2008,29(9):1845

[12]BROSNAN ME,MACMILLAN L,STEVENS JR,et al.Division of labour:how does folate metabolism partition between one-carbon metabolism and amino acid oxidation?[J].Biochem J,2015,472(2):135

[13]TÖGEL L,NIGHTINGALE R,CHUEH AC,et al.Dual targeting of bromodomain and extraterminal domain proteins, and WNT or MAPK signaling, inhibits c-MYC expression and proliferation of colorectal cancer cells[J].Mol Cancer Ther,2016,15(6):1217

[14]黄丽丽,祝小林,邓伟谦,等.p38 MAPK信号通路介导晚期氧化蛋白产物诱导的肾小管上皮细胞间充质转分化[J].南方医科大学学报,2016,36(9):1209

[15]张晓峰,张连峰,程鹏.胃腺癌组织中 Lgr5和 Wnt1蛋白的表达[J].郑州大学学报(医学版),2014,49(5):689

[16]曹静,吕志排,党秋红,等.宫颈腺癌组织中C-erbB-2与E-cadherin蛋白的表达[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(4):503

[17]SATPATHY SR,JALA VR,BODDULURI SR,et al.Crystalline silica-induced leukotriene B4-dependent inflammation promotes lung tumour growth[J].Nat Commun,2015,6:7064

(2016-03-23收稿 责任编辑徐春燕)

Detection of different DNA methylated genes in transdifferentiation of lung fibroblasts caused by free SiO2using MeDIP-seq

HOUJianyong,YAOWu,HAOChangfu

DepartmentofOccupationalHealth，CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

silicosis；DNA methylation；MeDIP-seq

Aim：To examine the different DNA methylated genes and possible mechanism in the transdifferentiation of lung fibroblasts caused by free SiO2. Methods: The primary macrophages and fibroblasts of SD rats were cultured, and then co-cultured. DNA methylation in fibroblasts with different infected time(0,24,48 h) was detected by MeDIP-seq. Results: A total of 8 791 different DNA methylated genes were discovered in all the three groups, and a further more analysis about those genes in KEGG pathway was performed by DAVID. The different DNA methylated genes were found enriched in metabolism, environmental information processing, cellular processes, organismal systems, human diseases pathway,etc. Conclusion: A large number of different DNA methylated genes and pathways exist in the pathogenesis of silicosis, which is valuable for further study.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.002

*国家自然科学基金资助项目 81102109，81472954

R135.2