肺淋巴循环障碍对矽肺发病进程的影响研究

崔 洁，陈紫莺，王宏丽，郭灵丽,2，郝小惠,2，刘和亮,2

矽肺是一种古老的尘肺病，主要由长期吸入游离二氧化硅(SiO2)引起，作为采矿和制造等行业工人面临的主要职业健康问题，每年可导致约24 000人死亡[1]。由于矽肺的发病机制尚不明确，目前尚未发现有效的治疗方法。因此，对其发病机制展开深入研究意义重大。有证据[2]表明，肺淋巴系统在矽肺发病机制中占据重要地位，淋巴结纤维化导致肺部矽尘的清除受阻，加速肺损伤。Yu et al[3]和课题组前期研究[4]表明，促进大鼠肺部淋巴管生成可改善矽肺大鼠肺淋巴转运，减少肺间质内SiO2沉积，延缓矽肺进展。但肺部淋巴循环障碍对矽肺发病进程的影响尚未有研究，该研究拟在探讨肺淋巴循环障碍对矽肺发病进程的影响。研究通过手术结扎大鼠胸导管，建立矽肺淋巴循环障碍模型，通过检测肺组织内淋巴管的变化以及参与淋巴管生成因子和纤维化进程相关因子的表达，从新的视角探讨肺淋巴管在矽肺发病机制中的重要作用，为矽肺的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级成年雄性SD大鼠24只(体质量180～250 g)购自北京华阜康实验动物有限公司，饲养于华北理工大学动物实验中心屏障实验室[SYXK(冀)2020-0007]；SiO2粉尘购自河北省煤矿卫生与安全重点实验室。该研究经华北理工大学动物伦理委员会批准(审批号：LX2019035)。

1.2 主要试剂与仪器天狼猩红染色试剂盒(北京雷根生物科技有限公司)，手术黏合剂(唐山华北理工大学附属医院)，苏木精(武汉珠海贝索生物科技有限公司)，平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(英国Abcam公司)，手术电凝针(张家港市航天医疗电器厂)，核转录因子(nuclear factor-κBp65，NF-κBp65)(美国Affinity Biosciences公司)，血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)(英国Abcam公司)。

1.3 动物分组与模型建立将28 d大鼠随机分为对照组、结扎对照组、矽肺组及矽肺+结扎组，n=6。对照组不做处理；结扎对照组大鼠被麻醉后先手术分离颈部组织，暴露胸导管，后采用手术电凝针将胸导管结扎，用手术黏合剂闭合手术部位，于小动物体温维持毯上进行术后保温，待其意识恢复后正常饲养1 d；矽肺模型组大鼠采用HOPE-MED8050系列动式染毒控制装置(染尘仓内浓度2 000 mg/m3，每天给予动式染尘3 h)建立矽肺模型；矽肺+结扎组大鼠先手术暴露并结扎胸导管，用手术黏合剂闭合手术组织后正常饲养1 d，然后给予与矽肺组相同处理。

1.4 肺组织病理学检查腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，将其固定于鼠板上。采用腹主动脉采血法处死大鼠，获取右下肺，并将其置于4%多聚甲醛固定液中，24 h后制作石蜡切片，并进行HE和天狼猩红染色。正置光学显微镜和偏振光显微镜下获取图片。其余肺组织分装于高压EP管内置于-80 ℃冰箱备用。

1.5 肺部淋巴管的变化将肺组织石蜡切片进行常规脱蜡至水，高压修复抗原。于切片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min。滴加LYVE-1(1 ∶100)，4 ℃过夜，滴加IgG聚合物37 ℃孵育30 min,用DAB显色试剂盒显色，常规复染，脱水透明，中性树胶封片，显微镜获取图像。

1.6 肺组织内细胞因子的检测将各组大鼠肺组织研磨匀浆，并提取肺组织蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转。孵育一抗 VEGFR-3(1 ∶800)、NF-κBp65(1 ∶500)、α-SMA(1 ∶500)于4 ℃冰箱内过夜。山羊抗兔或抗小鼠二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h。使用ECL发光试剂于ECLTM蛋白检测系统检测信号，使用Image J软件进行图像分析。

2 结果

2.1 病理学结果HE染色结果(图1)显示，与对照组相比，矽肺组大鼠肺组织内有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚；矽肺+结扎组大鼠相较于对照组和矽肺组病变更为严重，表现为肺泡结构被破坏，以巨噬细胞和成纤维细胞为主细胞性结节形成。

图1 HE染色 ×100 A：对照组；B：结扎对照组；C：矽肺组；D：矽肺+结扎组

2.2 天狼猩红染色结果如图2所示，与对照组比较，矽肺模型组大鼠肺组织内出现条索样Ⅰ(绿色)、Ⅲ型(强橙黄色)胶原沉积；与矽肺模型组相比，矽肺+结扎组大鼠肺组织内胶原沉积更为明显。

图2 天狼猩红染色 ×100 A：对照组；B：结扎对照组；C：矽肺组；D：矽肺+结扎组

2.3 肺组织内淋巴管免疫组化结果如图3所示，对照组内未观察到淋巴管，而矽肺组大鼠肺组织内有明显的LYVE-1阳性淋巴管的出现，矽肺+结扎组大鼠肺组织内有阳性淋巴管出现，但官腔萎缩塌陷。

图3 免疫组化染色 ×200

2.4 各组大鼠淋巴管生成因子VEGFR-3表达含量的比较与对照组相比，矽肺组大鼠肺组织内VEGFR-3的表达上调[分别为(0.35±0.01)、(0.97±0.03)]，差异有统计学意义(P<0.05)；结扎矽肺大鼠胸导管后，VEGFR-3的表达(0.87±0.01)相较于矽肺组下调，差异有统计学意义(F=1 356.72，P<0.05)。见图4。

图4 各组大鼠肺组织中VEGFR-3的表达

2.5 各组大鼠肺组织内炎症因子和致纤维化因子的表达含量的比较Western blot结果表明，与对照组相比，矽肺组大鼠肺组织内NF-κBp65[(1.80±0.01)vs(0.60±0.11)，F=421]和α-SMA[(2.57±0.01)vs(0.40±0.05)，F=1 801]的表达明显增高，矽肺+结扎组[分别为(2.42±0.05)、(3.24±0.06)]高于矽肺组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 各组大鼠肺组织中NF-κBp65和α-SMA的含量

3 讨论

矽肺是中国最严重的职业病[5]，SiO2的累积呼吸暴露量(暴露强度和持续时间的函数)是矽肺发生的主要因素[6]。矽肺动物模型的建立，为矽肺发病机制研究提供了便利。动式染尘是近年来新兴的一种建立矽肺模型的新方法[7]。此方法相较于以往的矽肺造模方式如一次性非气管暴漏灌注和暴漏气管灌注SiO2悬浊液，采用该方法建立矽肺动物模型可以较好的模拟工人接触SiO2粉尘的过程，减少因人为操作不当造成的动物死亡，但是此法耗时长，成本高。该研究HE和天狼猩红染色结果表明，采用动式染尘法成功建立了矽肺大鼠模型，且在造模过程中发现，动物未出现死亡情况。

由于矽肺的发病机制尚不明确，因此，对矽肺发病机制进行深入研究十分必要。课题组前期研究[4]表明，改善肺淋巴管循环可以有效的延缓矽肺病情进展，但是肺淋巴循环障碍对矽肺发病进程的影响尚待证实。胸导管是肺部淋巴系统通向体液循环系统的重要通道[8]。因此，结扎胸导管可中断正常淋巴循环。基于此，该研究旨在通过结扎胸导管建立肺淋巴循环障碍模型，探讨肺淋巴循环障碍对矽肺病情进展的影响。HE、天狼猩红染色结果显示，矽肺+结扎胸导管组大鼠肺组织病变更为严重，表明矽肺淋巴循环障碍模型建立成功。

淋巴管的活化、生成以及淋巴引流的增强可对机体的免疫反应和炎症过程产生一定调节作用，当淋巴管网络进行重塑时，淋巴组织引流能力加强，由此可去除体内积聚的组织液、免疫细胞、组织碎片、生长因子等加快炎症的消退[9]。巨噬细胞等白细胞受到刺激产生的大量VEGF-C是淋巴管生成的重要调节因子[10-11]，可使组织炎症部位及其下游淋巴结处的淋巴管密度增加。该研究免疫组化和免疫印迹结果显示，矽肺大鼠和矽肺+结扎组大鼠染尘后肺部出现了淋巴管增生，且淋巴管特异性标记因子VEGFR-3[12-13]的表达相较于对照组上调，推测大鼠染尘初期由于粉尘进入后被巨噬细胞吞噬，从而促进了肺部淋巴管增生，这与该课题组体外研究[14]结果一致。

胸导管到肺实质的淋巴循环异常是肺淋巴疾病的重要原因[15]。该研究进一步探讨了结扎矽肺大鼠胸导管后对矽肺发病进程的影响。该研究表明，矽肺+结扎胸导管组大鼠虽出现肺部淋巴管增生，但 NF-κBp65和α-SMA的表达均高于矽肺模型组，可能由于其胸导管被结扎，导致染尘初期肺内淋巴转运障碍，粉尘及炎性细胞因子不能及时排出而积聚于肺组织，导致炎症长时间无法消退，加重了肺组织损伤，从而导致了纤维化。

在对矽肺机制的研究[2]中，人们已经开始注意到淋巴结，尤其是肺门淋巴结在清除肺部粉尘中的作用，并认为淋巴结瘀滞堵塞可能是肺纤维化进展的一个因素。该研究首次探讨矽肺淋巴循环障碍对矽肺发病进程的影响，通过手术结扎胸导管成功建立肺淋巴循环障碍模型，并证明了肺淋巴循环障碍会加快矽肺病情进展。但是该研究未进行淋巴液T细胞的检测以确定结扎胸导管的成功率，其影响矽肺进程的具体机制也还需进一步探讨。