鸡骨泥酶解和发酵产物的成分分析及抗氧化活性比较

刘安康，卢美珍，陈慧，汪兰，付晓燕*

(1.武汉设计工程学院 食品与生物科技学院，武汉 430205；2.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，武汉 430064)

鸡骨泥酶解和发酵产物的成分分析及抗氧化活性比较

刘安康1，卢美珍1，陈慧1，汪兰2，付晓燕1*

(1.武汉设计工程学院 食品与生物科技学院，武汉 430205；2.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，武汉 430064)

将鸡骨泥采用蛋白酶酶解和混菌发酵处理，对原料、酶解产物和发酵产物中的活性成分进行分析并对其抗氧化活性进行研究，结果表明：酶解和发酵处理可使鸡骨泥的活性成分含量显著提高，尤其是经酶解-发酵联用技术处理样品后多肽、氨基酸态氮、总酸和呈味核苷酸二钠的含量较酶解产物进一步提高17.61%，38.93%，164.74%和32.95%。抗氧化实验结果表明：相同试样浓度下样品对DPPH和羟基自由基的清除能力大小顺序为发酵产物>酶解产物>原料，表明酶解-发酵技术不仅可以提高原料的利用率和风味，还可增强其营养保健功能。

鸡骨；酶解；发酵；活性成分；抗氧化活性

我国是畜禽养殖及其产品的消费大国，在肉类生产过程中，每年会产生近2000万吨的各类畜禽骨，但绝大多数骨都未得到充分利用，不仅造成巨大的浪费，还可能导致环境污染[1]。研究表明：骨中所含营养素非常丰富，如蛋白质、矿质元素、氨基酸、骨胶、粘多糖、生长素等[2]，其营养保健功能早已被人们所接受，利用畜禽骨开发新型、天然、绿色的营养食品及食品添加剂已成为新的研究热点。

酶解和发酵是提高畜禽骨可利用价值的重要方法。目前常用的酶主要是蛋白酶，畜禽骨经蛋白酶酶解后得到的产品具有比较高的骨胶原蛋白及钙含量[3]。发酵过程不仅可以产酸，还可通过分解脂肪和蛋白质产生多肽、酚及醇类风味物质等[4]。与单一的蛋白酶或菌株发酵水解骨蛋白相比，酶解-发酵联用技术对骨原料的利用率更高，同时还可增强其营养保健功能[5]。

一般来说，鸡骨中有机物占16%～33%，无机物占25%～26%，脂肪含量占8%～12%，水分含量占58%～62%，还有丰富的钙、磷、铁、锌等微量元素[6]。我国对鸡骨的开发利用比较晚，在其产品的多样性、加工工艺的优化等方面还需进一步改善。本研究以鸡骨为原料，采用蛋白酶对其进行酶解处理，并在酶解基料的基础上进行微生物发酵，通过对酶解和发酵产物中的活性成分及抗氧化活性进行比较，为畜禽骨的加工利用提供一定的理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡骨架 武汉白沙洲冻品市场；植物乳杆菌冻干粉、木糖葡萄球菌冻干粉和鲁氏酵母冻干粉 广东省微生物菌种保藏中心；风味蛋白酶和复合蛋白酶 诺维信中国生物技术有限公司；福林酚试剂、MRS培养基等其他化学试剂 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PL2002电子分析天平、FE20实验室pH计 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DF-101S恒温磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SPX系列生化培养箱 上海新苗医疗机械制造有限公司；SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鸡骨泥处理流程

鸡骨架→去头去尾→清洗→速冻→粉碎→酶解→混菌发酵→指标测定。

1.3.2 鸡骨泥酶解基料的制备

将鸡骨泥解冻后，按1∶1比例取鸡骨泥和水置于烧杯中，搅拌均匀，用磁力搅拌器于85 ℃下预处理0.5 h。调节温度至50 ℃，加入酶料比为6‰的风味蛋白酶，调节pH为7.0，酶解4 h；然后加入酶料比为5‰的复合蛋白酶，调节pH为7.0，酶解4 h。待反应完成后，升温至90 ℃灭酶0.5 h，冷却至室温后，去除酶解底料的大颗粒骨渣，将酶解液定容，得到产物即为鸡骨泥酶解基料。

1.3.3 鸡骨泥发酵产物的制备

采用混菌发酵法对鸡骨泥酶解基料进行发酵[7-9]。取30 mL的酶解基料于发酵瓶中，加入5%的氯化钠和1%的葡萄糖，灭菌、冷却后于超净工作台中接种6%的混菌发酵剂(植物乳杆菌、木糖葡萄球菌和鲁氏酵母比例为1∶1∶1)，将发酵瓶放入生化培养箱中，于40 ℃条件下培养4天，即得鸡骨泥发酵产物。

1.3.4 多肽的测定

采用福林-酚比色法[10]测多肽含量。称取样品2～3 g，用15%的TCA溶液溶解并定容至25 mL，混匀，静置5 min，过滤后吸取1 mL样液，加入福林酚试剂甲液5 mL，混匀，30 ℃下保温10 min；然后加入福林酚试剂乙液0.5 mL，立即振荡摇匀，30 ℃下准确保温40 min，于500 nm处测定吸光值，并通过标准曲线计算多肽的含量(g/100 g)。

1.3.5 氨基酸态氮的测定

称取均匀样品3～4 g，用适量的水溶解，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取10.00 mL，置于200 mL烧杯中，加入60 mL水，开动磁力搅拌器，加入甲醛溶液10 mL，记录pH从8.20变化至9.20时消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数，同时做试剂空白实验。

1.3.6 总酸的测定

称取均匀样品3～4 g，用适量的水溶解，移入25 mL比色管中，加水至刻度，混匀后过滤，吸取滤液5 mL于200 mL锥形瓶中，加入20 mL水，滴加2滴酚酞指示剂(10 g/mL)，摇匀，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液颜色变为微红，记录消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数，同时做试剂空白实验。

1.3.7 呈味核苷酸二钠的测定

用万分之一天平精确称取呈味核苷酸二钠标准物质约0.1 g，用0.01 mol/L HCl定容至100 mL，分别配制成稀释倍数为25，40，50，80，100的系列溶液，以0.01 mol/L HCl溶液作为空白，于250 nm处测定吸光值，绘制标准曲线。称取样品约1 g，用0.01 mol/L HCl定容至100 mL，过滤后于250 nm处测其吸光值，通过标准曲线计算样品中呈味核苷酸二钠的含量。

1.3.8 清除DPPH自由基能力的测定

先将样品进行过滤，然后配制成不同浓度梯度，分别取不同浓度的样品溶液3 mL，加入等体积的0.16 mmol/L DPPH自由基乙醇溶液，摇匀，避光反应15～20 min，于517 nm 处测定试样吸光度(Ai)。以等体积的蒸馏水代替样品测得空白吸光度(A0)，以等体积的蒸馏水代替DPPH自由基乙醇溶液测得样品本底吸光度(Aj)，每个样品浓度做3个平行，按下式计算清除率：

清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。

1.3.9 清除羟基自由基能力的测定

采用Fenton反应，利用H2O2与Fe2+混合产生羟基自由基(·OH)，在该体系中加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收。先将样品进行过滤，然后配制成不同浓度梯度，分别取不同浓度的样品溶液4 mL，9 mmol/L FeSO40.5 mL，9 mmol/L水杨酸0.5 mL，8.8 mmol/L H2O20.5 mL，混匀，37 ℃水浴中加热30 min，于510 nm处测定样品吸光度(Ai)。以4 mL蒸馏水代替样品测得空白吸光度(A0)，以0.5 mL蒸馏水代替8.8 mmol/L H2O2测得样品本底吸光度(Aj)，每个样品浓度做3个平行，按下式计算清除率：

清除率=[ A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。

2 结果与分析

2.1 鸡骨泥酶解和发酵产物中多肽含量的变化

图1 鸡骨泥原料、酶解和发酵产物中的多肽含量

由图1可知，鸡骨泥经过酶解和发酵后，多肽的含量显著增大(P<0.05)。原料中多肽含量仅为0.13 g/100 g，而酶解产物中多肽含量可达5.10 g/100 g，经混菌发酵后，多肽含量较酶解产物又进一步提高了17.61%，可能是由于鸡骨泥在发酵过程中蛋白质被微生物分泌的蛋白酶分解，转化为多肽等小分子物质。

2.2 鸡骨泥酶解和发酵产物中氨基酸态氮含量的变化

图2 鸡骨泥原料、酶解和发酵产物中的氨基酸态氮含量

由图2可知，鸡骨泥经过酶解和发酵后，氨基酸态氮的含量显著增大(P<0.05)。原料中氨基酸态氮含量仅为0.03 g/100 g，而酶解产物和发酵产物中的氨基酸态氮含量分别为0.13，0.18 g/100 g，表明鸡骨泥经酶解和发酵后蛋白质大分子被分解，以氨基酸形式存在的氮元素含量显著提高，且发酵产物中氨基酸态氮含量较酶解产物增加38.93%。

2.3 鸡骨泥酶解和发酵产物中总酸含量的变化

图3 鸡骨泥原料、酶解和发酵产物中的总酸含量

由图3可知，鸡骨泥经过酶解和发酵后，总酸含量显著增大(P<0.05)。原料中总酸含量仅为1.33 g/kg，酶解产物中总酸含量上升至9.35 g/kg，可能是由于鸡骨泥经酶解后游离氨基酸含量提高所致。混菌发酵后，总酸含量大幅提高，可达24.74 g/kg，主要是由于混菌发酵剂中植物乳杆菌和木糖葡萄球菌在发酵过程中会产生大量有机酸，且与发酵时间呈正相关。

2.4 鸡骨泥酶解和发酵产物中呈味核苷酸二钠含量的变化

呈味核苷酸二钠(I+G)是一种新型的高级调味剂，在食品工业中越来越受到重视[11]，可由酵母所得核酸分解、分离制得或由发酵法制取。

图4 鸡骨泥原料、酶解和发酵产物中的呈味核苷酸二钠含量

由图4可知，鸡骨泥经酶解和发酵后，I+G含量均有所提高，表明酶解和发酵产物的鲜味明显增强，且发酵产物较酶解产物的I+G含量提高32.95%，可成为食品天然增鲜剂的良好来源。

2.5 鸡骨泥酶解和发酵产物的抗氧化活性比较

2.5.1 清除DPPH自由基的能力

图5 鸡骨泥原料、酶解和发酵产物清除DPPH自由基的能力

由图5可知，随着试样浓度提高，3个样品对DPPH自由基的清除率均逐渐增大。相同试样浓度下，酶解产物对DPPH自由基的清除能力略高于原料，而发酵产物对DPPH自由基的清除能力则显著提高，当试样浓度为10 mg/mL时，其清除率可达47.4%，可能是由于发酵处理后小分子短肽与氨基酸的比例增加，使其抗氧化活性得以提高。

2.5.2 清除羟基自由基的能力

图6 鸡骨泥原料、酶解和发酵产物清除羟基自由基的能力

由图6可知，随着试样浓度提高，3个样品对羟基自由基的清除率均逐渐增大，但其清除能力存在一定差异，相同试样浓度下，3个样品对羟基自由基的清除能力大小顺序为发酵产物>酶解产物>原料，表明鸡骨泥经酶解和发酵处理后产生了更多的抗氧化物质，这与清除DPPH自由基的研究结果是一致的。

3 结论

研究发现：鸡骨泥经酶解处理后，多肽、氨基酸态氮、总酸和呈味核苷酸二钠等活性成分含量显著提高，而酶解-发酵技术处理样品对活性成分含量进一步提高，可使多肽、氨基酸态氮、总酸和呈味核苷酸二钠的含量较酶解产物分别提高17.61%，38.93%，164.74%和32.95%。抗氧化实验结果表明：相同试样浓度下，样品对DPPH和羟基自由基的清除能力大小顺序均为发酵产物>酶解产物>原料，可能是由于鸡骨泥经酶解和发酵处理后小分子短肽与氨基酸的比例增加，使其抗氧化活性得以提高，表明酶解-发酵技术不仅可以提高原料的利用率和风味，还可增强其营养保健功能。

[1]张根生，王子谛，郭洁，等.畜禽骨骼营养成分提取分离技术及应用进展[J]．肉类研究，2011(12)：48-52．

[2]孙蓓，王龙刚．畜禽骨的综合利用现状及发展前景[J]．中国调味品，2011，36(4)：1-13.

[3]郑明强，李新文，仇宏伟，等．从鸡骨中提取骨胶原的酶解工艺研究[J]．烟台大学学报，2010，23(2)：161-164．

[4]朱胜华，车振明．微生物在发酵肉制品中的应用[J]．食品科技，2011，36(10)：104-110．

[5]王帅楠，宗红，陆信曜，等．利用酶解-发酵联用技术提高猪骨泥的功能性[J]．食品与发酵工业，2015，41(4)：87-90．

[6]李睿，王海燕，尚永彪．鸡骨的综合利用研究进展[J]．肉类工业，2010(11)：54-57．

[7]王晓婷，贺银凤．肉制品发酵剂菌种筛选及发酵工艺条件优化[J]．食品工业，2012(7)：5-8．

[8]贾士芳，陈美玲，钟瑾，等．肉制品发酵剂木糖葡萄球菌I2的研究[J]．食品与发酵工业，2006(8)：72-74．

[9]左勇，谢晖，鞠帅，等．猪骨酶解液乳酸菌发酵条件的研究[J]．中国调味品，2012，37(2)：55-58．

[10]鲁伟，任国谱，宋俊梅．蛋白水解液中多肽含量的测定方法[J]．食品科学，2005，26(7)：169-171．

[11]徐玮，谭红，宋光林，等．紫外光度法测定增鲜味精中呈味核苷酸二钠的含量[J]．食品工业科技，2010，31(12)：344-348．

Comparison of Component Analysis and Antioxidant Activity of Chicken Bone Paste Processed by Enzymolysis and Fermentation

LIU An-kang1, LU Mei-zhen1, CHEN Hui1, WANG Lan2, FU Xiao-yan1*

(1.College of Food & Biology Science and Technology, Wuhan Institute of Design and Sciences, Wuhan 430205,China;2.Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-agricultural Technology,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)

Comparison of active components and antioxidant activity of chicken bone paste processed by enzymolysis and fermentation are performed. The results show that the enzymolysis and fermentation technology could significantly increase the active components'content, especially the enzymolysis-fermentation technology. The content of polypeptide, amino acid nitrogen, total acid and flavor nucleotides disodium in the fermentation product is increased by 17.61%, 38.93%, 164.74% and 32.95% respectively compared with the enzymatic hydrolysate. The antioxidation experiment results indicate that the order of radical scavenging activity is fermentation product, enzymatic hydrolysate and raw material. The enzymolysis-fermentation technology has not only improved the raw material utilization ratio and flavor, but also enhanced its nutrition and health function.

chicken bone; enzymolysis; fermentation; active components; antioxidant activity

2016-07-12 *通讯作者

武汉设计工程学院大学生科技创新项目(201302)

付晓燕(1985-)，女，湖北武汉人，讲师，硕士，研究方向：天然产物化学。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.016

1000-9973(2017)01-0072-04