淡水鱼加工副产物低盐鱼露生化特性的研究

周敏，袁美兰，陈丽丽，赵利，吴朝朝，金达丽

(江西科技师范大学 生命科学学院，国家淡水鱼加工技术研发分中心，南昌 330013)

淡水鱼加工副产物低盐鱼露生化特性的研究

周敏，袁美兰，陈丽丽，赵利*，吴朝朝，金达丽

(江西科技师范大学 生命科学学院，国家淡水鱼加工技术研发分中心，南昌 330013)

以淡水鱼加工副产物为原料，采用分段加盐，后期添加耐盐酱油酵母的方法生产鱼露，并对其生化特性进行研究。结果表明：在发酵过程中，氨基酸态氮(AA-N)、可溶性总氮(TSN)、总酸和挥发性盐基氮(TVB-N)的含量先上升后逐渐下降，赋香发酵后显著下降；pH先显著下降，随后基本保持不变；食盐含量在发酵过程中略有上升；活菌数和混合蛋白酶的活力在发酵过程中变化较复杂；在发酵过程中游离氨基酸的含量先增加后略有降低，赋香发酵后显著降低。

淡水鱼加工副产物；低盐鱼露；发酵；生化特性

鱼露又称为鱼酱油、虾油，是我国沿海地区及日本、东南亚各国人们所喜爱的传统发酵产品[1]。传统的鱼露是以低值的鱼虾为原料，利用鱼体内所含的蛋白酶和其他酶，以及多种微生物共同作用下发酵而成[2]。由于传统的鱼露含盐量比较高，所以近年来低盐鱼露的生产工艺已经成为人们研究的热点。

我国是淡水鱼生产大国，每年淡水鱼的加工会产生大量的副产物，目前我国淡水鱼加工副产物主要用于生产动物饲料和直接丢弃，这不仅造成了环境问题，而且浪费了蛋白质资源。本文以淡水鱼加工副产物为原料，采用现代生物技术和酶工程技术来生产鱼露，同时在工艺上运用了分段加盐法，在发酵后期添加耐盐酱油酵母生产鱼露，并对鱼露的生化特性进行了研究。因此，对淡水鱼加工副产物低盐鱼露风味的研究有利于鱼露生产的标准化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淡水鱼加工副产物(水分76.56%，蛋白质8.65%，灰分7.98%，脂肪8.32%)：来源于江西鄱阳湖水产食品有限公司，平板冻结后送到实验室，-18 ℃冷冻保存，使用前在10 ℃以下进行流水解冻。

3.042 酱油曲 北京酿造所；风味蛋白酶 丹麦诺维信有限公司；耐盐酱油酵母 安琪酵母股份有限公司；平板琼脂计数培养基 青岛高科园海博生物有限公司；干酪素(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

HA-300MD型高压灭菌器 Hirayama Manufacturing Corporation；BHC 1000ⅡA/B3型生物安全柜 苏州安泰空气技术有限公司；Stomacher 400均质机 英国Seward公司；Waters-2695高相液相色谱仪 美国Waters有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼露样品的制备方法

按照吴朝朝[3]的最佳优化工艺条件生产鱼露。鱼露发酵醪液包括淡水鱼加工副产物低盐自溶水解物、酱油曲20%(酱油曲/浆，W/W)，蛋白酶添加量0.1%(酶/浆，W/W)，加水比0.25∶1(水/浆，W/W)，食盐5%。调节发酵醪液的初始pH为6.0，将500 mL混合发酵物装于1000 mL 烧杯中，烧杯口使用两层保鲜膜封口。将烧杯置于50 ℃ 恒温培养箱中，在发酵期间早晚各搅拌1次，发酵25天后将鱼露样品于90 ℃灭菌20 min，冷却至室温后于5000 r/min 离心15 min，过滤，再添加酱油酵母0.584%(酵母/鱼露，V/V)，置于35 ℃的恒温培养箱中赋香发酵7天。对样品进行各种指标分析，于发酵第1，5，10，15，20，25，32天取样分析。测蛋白酶活力时，离心、过滤后不经过灭菌操作；微生物检测时也不经过灭菌操作且在无菌条件下采样。

1.3.2 pH的测定

pH的测定直接采用pH计法。

1.3.3 氨基酸态氮、总酸的测定

氨基酸态氮采用甲醛滴定法[4]：取稀释样品20 mL，加入60 mL水，用0.05 mol/L NaOH滴定到pH 9.6，记录消耗的体积来确定样品中总可滴定酸，然后加10 mL 37%的甲醛溶液，继续滴定到pH 9.2，记录总消耗的体积来确定甲醛态氮的含量。

1.3.4 可溶性总氮的测定

可溶性总氮的测定采用凯氏定氮法[5]。

1.3.5 挥发性盐基氮的测定

挥发性盐基氮的测定采用康威微量扩散法[6]。

1.3.6 食盐含量的测定

食盐含量的测定参照GB/T 12457-2008《食品中氯化钠的测定》。

1.3.7 非酶褐变指数的测定

非酶褐变指数采用Hendel法[7]，取5 mL样液用50 mL 50%的乙醇提取1 h，其间不断搅拌。提取液经过滤纸 (双圈牌，102型) 过滤。滤液用分光光度计在420 nm处测定吸收值。

1.3.8 游离氨基酸成分分析

采用高效液相色谱法(波长254 nm，温度38 ℃，流速1 mL/min)，鱼露样品中氨基酸的浓度通过标准氨基酸来计算。

1.3.9 蛋白酶活力的测定

采用SB/T 10317-1999的方法测定。

1.3.10 菌落总数的测定

具体操作参照GB 4789.2-2010《菌落总数的测定》。发酵到规定的取样时间，在无菌条件下取出样品，稀释到不同的梯度进行接种，在35 ℃培养48 h后进行菌落计数。

1.4 统计分析

结果使用 (平均值±标准差)表示，所有实验平行3次。采用Excel 2007和Origin 75进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 氨基酸态氮和可溶性总氮含量的变化

氨基酸态氮和可溶性总氮的含量是评价蛋白质降解程度和鱼露质量的一个重要指标，也是鱼露分级的重要依据[8]。

图1 鱼露中氨基酸态氮和可溶性总氮含量的变化

由图1可知AA-N和TSN在发酵过程中的变化，AA-N含量的变化趋势与TSN含量的变化相似。AA-N的含量在发酵前15天随着发酵进行而不断增加，在发酵15天时达到了1.337 g/dL，随后又逐渐下降；TSN的含量在前10天随着发酵时间的延长而不断增加，在发酵10天时达到了2.016 g/dL，随后又逐渐下降；赋香发酵7天后，二者都进一步有所减少。随着发酵的进行，蛋白酶的活力也会逐渐下降，所以二者的含量不会一直保持增加的趋势；二者下降的原因可能是部分氨基酸与醛、酮类物质发生了美拉德反应而被消耗了，因为随着发酵时间的延长非酶褐变指数在不断增加；另一方面可能是部分氨基酸在一些腐败微生物的作用下生成了挥发性盐基氮和生物胺等物质。发酵完全结束后鱼露中的AA-N和TSN含量分别为1.289，1.747 g/dL，都超过了国家一级鱼露的标准[9]。

2.2 pH和总酸含量的变化

鱼露在发酵过程中酸度和pH的变化也是反映其发酵程度的一个重要指标，有机酸对鱼露的呈味起着重要作用[10]。

图2 鱼露中pH和总酸含量的变化

由图2可知pH和总酸在发酵过程中的变化，pH和总酸含量的变化基本上呈相反的趋势。在发酵前15天，鱼露中的pH显著下降，随后基本保持不变，发酵结束后鱼露中的pH为5.01；在发酵前15天，鱼露中的总酸含量显著上升，随后逐渐下降，发酵结束后总酸含量为1.70 g/dL。

pH和总酸含量的变化主要是因为发酵过程中在一些微生物，如耐盐乳酸菌等的作用下产生的有机酸类物质以及蛋白质被发酵分解成碱性的挥发性盐基氮类物质以及氨基酸等共同作用的结果。在发酵前15天，鱼露中的耐盐乳酸菌是优势菌，它的快速生长使pH显著下降，总酸含量升高，随后腐败菌生长较旺盛，产生了生物胺和挥发性盐基氮等碱性物质，使pH的下降趋于缓慢，总酸含量下降；同时一些挥发性酸类物质在发酵过程中的挥发也会使总酸含量下降。

2.3 挥发性盐基氮含量的变化

TVB-N是衡量鱼露腐败程度的一个重要指标[11]。

图3 鱼露中挥发性盐基氮含量的变化

由图3可知TVB-N的变化，在发酵前10天，TVB-N随发酵时间的延长显著上升，随后缓慢下降，赋香发酵7天后显著下降，低于发酵初的含量。TVB-N的变化主要是因为在发酵初期发酵液中的一些腐败菌未被抑制住，同时酱油曲带过来的一些细菌发酵分解蛋白质也会使TVB-N的含量升高；随着发酵时间的延长、耐盐菌的增加以及发酵过程中挥发掉一部分使其有所减少；添加耐盐酱油酵母后，酵母菌成为优势菌，使杂菌被抑制住，挥发性盐基氮显著降低。

2.4 NaCl含量的变化

本研究的目的是生产一种低盐鱼露，高浓度的食盐会掩盖鱼露的风味，且不利于发酵。食盐含量的变化见图4。

图4 鱼露中食盐含量的变化

在整个发酵过程中，食盐的含量略有上升，整体上变化不大，添加耐盐酵母进行赋香发酵后食盐的含量显著下降，可能是添加酵母发酵液后使鱼露体积增加导致的。

2.5 非酶褐变指数的变化

非酶褐变指数也称为美拉德褐变指数，是发酵过程中产生的氨基酸与醛、酮类等物质发生羰氨反应形成的。非酶褐变指数的变化见图5。

图5 鱼露中非酶褐变指数的变化

在整个发酵过程中，非酶褐变指数不断上升，赋香发酵结束后达到了1.14。由此说明鱼露的色泽是在发酵过程中不断形成的。

2.6 蛋白酶活力的变化

发酵液中含有多种蛋白酶，包括添加的风味蛋白酶、酱油曲分泌的蛋白酶以及一些微生物在繁殖过程中产生的蛋白酶，所以测定的蛋白酶活力为混合蛋白酶的活力。混合蛋白酶的活力变化见图6。

图6 鱼露中蛋白酶活力的变化

在发酵前5天，蛋白酶的活力略有上升，从第5天到第10天蛋白酶活力显著下降，从第10天到第15天左右又显著上升，随后又逐渐下降。蛋白酶活力的变化主要是由食盐浓度、微生物产酶等多种因素影响的。起初食盐的浓度逐渐上升，酱油曲中的米曲霉还没有完全适应生长，所以会使蛋白酶的活力降低；随后酱油曲中的米曲霉快速繁殖，分泌蛋白酶，使蛋白酶的活力上升；发酵后期蛋白酶的活力又逐渐下降，主要是因为随着发酵的进行及底物浓度的降低，发酵液中pH的变化、总酸的变化以及多种代谢产物的产生使蛋白酶的活力降低。

2.7 菌落总数的变化

菌落总数是鱼露的重要生物指标之一，也是判别食品卫生质量的一项重要依据[12]。鱼露发酵过程中活菌数的变化见图7。

图7 鱼露中活菌数的变化

在发酵开始的前5天活菌数有所下降，在第5天到第10天活菌数略有上升，随后活菌数逐渐减少，添加耐盐酵母进行赋香发酵后，鱼露中的活菌数显著上升。在发酵初期由于食盐的添加使非耐盐菌的数量减少，随后一些耐盐的乳酸菌等成为优势菌，开始繁殖，酱油曲中的微生物适应条件也开始繁殖，使活菌数略有上升；随着发酵的进行，大量代谢产物积累，营养素消耗，pH降低等都不利于细菌的生长，所以活菌数逐渐下降；发酵后期添加了耐盐酱油酵母发酵液使活菌数增加。

2.8 游离氨基酸含量的变化

鱼露中氨基酸的含量和组成影响鱼露的风味和营养[13]。鱼露中60%～80%的氨基化合物为氨基酸，其中谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸和撷氨酸等被认为是鱼露鲜味的有效成分[14]。鱼露在发酵过程中氨基酸含量和组成见表1。

表1 低盐鱼露发酵过程中游离氨基酸组成与含量变化

由表1可知，亮氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、 缬氨酸、亮氨酸和赖氨酸是鱼露发酵过程中的主要氨基酸。随着发酵过程的进行，各种游离氨基酸的含量先不断增加，随后略有下降，添加耐盐酱油酵母进行赋香发酵后，显著下降；氨基酸的总含量也发生了相似的变化。氨基酸含量的变化趋势同发酵过程中AA-N和TSN含量的变化。主要是因为在发酵初期发酵液中的蛋白质被不断水解成氨基酸，使其含量不断增加；随着发酵的进行部分氨基酸转化成挥发性盐基氮和生物胺等物质，且美拉德反应的继续进行也在不断消耗氨基酸，这些反应的共同作用使氨基酸含量发生了变化；添加耐盐酱油酵母发酵液后可能使鱼露的体积增大，氨基酸的浓度被稀释而导致其含量显著降低。

3 结论

发酵过程中AA-N，TSN，总酸和TVB-N的含量先上升后逐渐下降，赋香发酵后显著下降，发酵结束后分别达到了(1.289±0.01)，1.747，(1.760±0.03) g/dL和(174.35±2.52) mg/100 g。pH先显著下降，随后基本保持不变，发酵完成时为(5.01±0.01) g/dL。食盐含量在发酵过程中略有上升，赋香发酵后显著降低，发酵结束后为(13.354±0.09) g/dL。活菌数和混合蛋白酶的活力在发酵过程中变化较复杂；游离氨基酸含量在发酵过程中先增加，随后又略有降低，赋香发酵后显著降低。

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Study on the Biochemical Characteristics of Low-salt Fish Sauce with By-products of Freshwater Fish

ZHOU Min, YUAN Mei-lan, CHEN Li-li, ZHAO Li*, WU Zhao-zhao, JING Da-li

(College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Branch of Research and Development on Freshwater Fish Processing Technology, Nanchang 330013, China)

Take freshwater by-products as the raw materials to produce fish sauce by adopting the methods of adding salt piecewise and adding salt-tolerant soy sauce yeast at the late stage. The biochemical characteristics are researched during the fermentation process. The results show that the content of AA-N, TSN, total acids and TVB-N increases firstly during the initial fermentation time and then slightly decreases thereafter and decreases significantly after flavor fermentation respectively. The pH value decreases significantly firstly and generally remains stable. The salt content increases slightly during the fermentation. The change of viable count and mixed protease activity is complex during the fermentation. The content of free amino acid increases firstly during flavor initial fermentation time and then slightly decreases thereafter.

freshwater by-products; low-salt fish sauce; fermentation; biochemical characteristics

2016-07-15 *通讯作者

南昌市农业科技支撑计划项目(洪财企[2012]80号)；江西省现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目；江西省科技厅科技支撑重大项目(20152ACF60008)

周敏(1991-)，女，河南安阳人，硕士，研究方向：食品化学； 赵利(1967-)，女，江西南昌人，教授，博士，研究方向：食品化学。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.005

1000-9973(2017)01-0018-05