马铃薯病毒检测技术的研究进展与现状分析

刘海英，陈建保，康 俊，张 浩，俎爱忠，景思远

（1.乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布 012000；2.乌兰察布市产品质量计量检测所，内蒙古乌兰察布 012000）

马铃薯病毒检测技术的研究进展与现状分析

刘海英1，陈建保1，康 俊1，张 浩2，*俎爱忠2，景思远2

（1.乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布 012000；2.乌兰察布市产品质量计量检测所，内蒙古乌兰察布 012000）

论述了马铃薯病毒检测技术的研究进展，主要介绍了目测法、指示植物鉴定法、电子显微镜检测法、血清学检测法、分子生物学等检测法，同时对每种检测法进行了简要评价，为从事马铃薯病毒检测工作提供帮助。

马铃薯；病毒检测；技术

目前对马铃薯产量和品质有影响的马铃薯病毒病有20多种，其中6种马铃薯病毒是我国目前检测马铃薯病毒的必检项目，包括马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯 S病毒 （PVS）、马铃薯 M病毒（PVM）、马铃薯A病毒（PVA），此外还有一种马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）属于类病毒类，也是必检测的指标[1]。马铃薯病毒病会造成减产10%～30%，严重的甚至可以达到80%以上。由于病毒具有个体小且专性依赖寄主的特性，所以对病毒进行鉴定时技术要求很高。以前常根据病毒在寄主体内寄生后的生物学特性来鉴别，随着分子生物学发展，现在多采用病毒的核酸、病毒蛋白的分子生物学鉴别方法，提高了病毒鉴定的准确性[2]。

1 观察鉴定法

观察鉴定法是根据不同病毒寄生在马铃薯植株上以后，植株将会表现出不同的症状，通过直接观察植株症状来初步判断是否感染病毒的一种方法。植株感染病毒后在田间所表现出的特征症状经常还会受到寄主的品种、寄主的生育期、外界环境、病毒种类等方面因素的影响，所以该方法的准确适用会受到观察者实践经验的影响，只有观察者具备丰富实践经验才能做出准确判断，该方法只能起初步识别的作用，不能就此下最终结论[3]。此方法简便易行，不需要设备，但是要求鉴定者具有丰富的实践经验。

2 指示植物法

指示植物指的是能够对马铃薯某一种病毒具有过敏反应，被这种马铃薯病毒感染就能很够快速表现出特定症状的一类植物，即鉴别寄主植物。该方法需要取待鉴定病株的任何组织部分进行研磨制成汁，然后通过石英砂摩擦或者采用嫁接的方法将其接种到指示植物上，等到表现出症状后进行观察，根据只是植物的症状反应来初步判定所接种待检病株含有的病毒种类[4]。

该方法操作简单，无需贵重的仪器设备和药品，只要具有一定的空间和隔离条件，操作者具有丰富的症状判断经验就可实现，多数种薯生产者自己就能操作。但是，其存在主要问题是培育指示植物需要一定的时间，需要提前准备；指示植物需要占据一定的空间，要求提供一定的场地；另外，该方法灵敏度不够高，所以同样也不能作为最终鉴定的结果；不适用于鉴定大批量生产马铃薯试管苗，多应用在鉴定病毒株系上，或者是在分子生物学鉴定之前进行的初步鉴定。

3 电镜检测法

电镜检测法是利用电子显微镜来观察待检样品中是否含有某种病毒。电子显微镜是通过电磁波作为光源，把感病植物的组织制成样本，直接进行观察，依据病毒的大小、形态，以及一些典型的超微结构等来判断病毒的存在和种类。洪健等人[5]利用电子显微镜观察烟草花叶病毒（TMV）以后，电子显微镜逐步发展成为研究植物病毒的常规手段。电子显微镜的分辨率非常高，甚至可以高达0.1 nm。但是由于电子束的穿透力比较低，这就对样品的厚度有特殊要求，要求样品厚度必须在10～100 nm。常用的电子显微镜检测法主要有负染技术和免疫电镜技术。负染技术的原理是通过将重金属盐堆积在样品四周，加强了样品外围的电子密度，从而使得样品显示出负的反差，以此来衬托样品的形态和大小。负染技术比超薄切片法简便、快速、分辨率高。而免疫电镜技术是可以将免疫学原理结合电镜技术，它不仅可以观察病毒的形态结构，而且可以判断出病毒的血清学关系。张仲凯等人[6]通过免疫吸附电镜技术鉴定出了马铃薯X病毒。该方法需要昂贵的仪器设备，操作过程复杂且操作技术要求高，必须经过专业的学习才能很好地掌握，但是具备准确度高、耗时短的优点。

4 免疫检测法

免疫法是指利用免疫学上病毒抗原与其相应的抗体存在抗原抗体特异性结合反应的原理，通过将特定的抗体标记在载体上，然后与待检测样品接触，如果发生了抗原抗体特异性反应，就证明待检样品中存在相应的病毒抗原，从而检测出样品中病毒的存在。在1927年首次应用这种生物学上的免疫反应方法研究了植物病毒的存在[7]。含有某一种病毒抗体的血清称为该病的抗血清。植物病毒结构中最外层的衣壳是蛋白质，具有蛋白抗原的特性，通过提纯植物病毒，然后将病毒注射在小动物（小白鼠、鸡等）体内，在动物体内引起动物体的免疫应答反应，将会在血清中产生出相应的抗体，采血后可得到该病毒的特异性抗血清。病毒的纯化是制备抗血清的关键，提纯的病毒纯度越高得到抗血清的特异性就越强。

据免疫学原理现在已有多种鉴定病毒的方法了，在马铃薯病毒检测上最常用的方法是酶联免疫吸附法（ELISA）。ELISA法是利用抗原抗体特异性免疫反应与高效酶催化反应结合起来的原理，通过酶催化后的显色反应来检测到马铃薯中病毒的存在及其含量的多少，显色反应后显示的颜色越重，证明病毒的含量就越多，可以使用酶联免疫测定仪来准确测定出病毒。现在有多种试剂盒可供选择，利用试剂盒法操作简单、耗时短、灵敏度高、特异性强、结果判断较准确、适用于大批量样品检测等优点。该技术不断发展和改进，目前主要有直接法、间接法、双抗体夹心法等多种检测方法。

5 核酸杂交及PCR检测法

植物病毒体内的核酸是具有侵染寄主的能力，因此通过检测核酸的存在是鉴定植物病毒更可靠的一种方法，目前常用核酸检测法有核酸杂交和聚合酶链式反应（PCR）法。

核酸斑点杂交技术（NASH）是利用核酸与自己的互补链可以互补结合，通过把标记了的核酸单链制成探针，让其与互补的待测病毒的核酸进行杂交，如果杂交成功就证明待测核酸片段存在，从而证明含有核酸的病毒存在。聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增DNA的技术，因为大多数植物病毒含有的是RNA，需要在扩增DNA前把RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增，故一般称为RT-PCR法。此方法具有简便快速、高灵敏度、高特异性、高重复性等优点。随着不断发展创新，目前有常规RT-PCR法、一步RT-PCR法、简并引物PCR技术、多元RT-PCR技术、实时荧光RT-PCR等多种PCR法。PCR检测技术已成功应用在检测PVX、PVY、PVA、PVM、PVS、PLRV、PSTVd等的存在。实时荧光RT-PCR是最有发展前景的一种植物病毒检测方法，具有实时检测、操作简单、灵敏度高、同时检测多种病毒等优点。采用实时荧光RT-PCR检测马铃薯上的PMTV、TRV和PVY的N株系，结果比常规RT-PCR检测TRV的灵敏度增加了100倍。此方法具有简便快速、高灵敏度、高特异性、高重复性等优点。

目前，提高马铃薯种薯质量需要依赖马铃薯病毒检测技术，灵敏度高又准确可靠的病毒检测方法对马铃薯产业的发展有重要作用。另外，马铃薯病毒检测费用的降低也是普及扩大马铃薯病毒检测的重要影响因素。因此，马铃薯病毒检测技术应该朝着降低成本、提高灵敏度、缩短时间等方向发展，才能更好地满足马铃薯病毒检测的需求。而对于种薯生产企业来说，在具备了病毒检测技术的同时还应该加强认识，加强对脱毒试管苗的病毒检测，保证脱毒种薯的品质，为马铃薯产业发展从源头提供保障。

[1]刘全永.马铃薯病毒检测及其抗病毒基因工程研究进展 [J].生物学通报，2001，36（1）：12.

[2]杨雪芹，向本春，施磊.马铃薯脱毒及脱毒苗检测技术的研究进展 [J].安徽农学通报，2007，13（8）：98-100.

[3]裘维蕃.植物病毒学 [M].北京：科学出版社，1985：270.

[4]徐洁.指示植物鉴定马铃薯病毒技术的研究与应用 [J].中国马铃薯，2002，16（2）：73-74.

[5]洪健，陈集双，周雪平，等.植物病毒的电镜诊断 [J].电子显微学报，1999，18（3）：274-279.

[6]张仲凯，魏春红.导致云南马铃薯品种中甸红退化的PVX分离物提纯及鉴定 [J].西南农业学报，2003，16（1）：78.

[7]宋吉轩，范士杰，董颖苹，等.应用改进的DAS-ELISA法快速检测马铃薯病毒 [J].贵州农业科学，2006，34（5）：69-70.

Research Progress and Present Situation Analysis of Potato Virus Detection Technique

LIU Haiying1，CHEN Jianbao1，KANG Jun1，ZHANG Hao2，*ZU Aizhong2，JING Siyuan2
（1.Ulanqab Vocational College，Ulanqab，Inner Mongolia 012000，China；2.Ulanqab Product Quality Measurement and Testing Institute，Ulanqab，Inner Mongolia 012000，China）

This paper summarized the progressmade in the research about potato virus detection.It briefly introduced themethods ofvisual observation，indicator plants，electron microscopic method，sero-logical detection andmolecular biology，etc.It also provided a brief evaluation on eachmethod.

potato；virus detection；technique

S435.32

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.040

1671-9646（2017） 11b-0046-02

2017-09-28

内蒙古质检系统科研项目（2015006）；内蒙古教育厅高校研究项目（NJSY17566）。

刘海英（1975— ），女，硕士，副教授，研究方向为马铃薯组培及病毒检测方面的教学和科研。*

俎爱忠（1973— ），男，本科，高级工程师，研究方向为产品质量检验。