己酸菌培养过程中提高质量的新举措

司波，常春，姜雪

（宿迁市产品质量监督检验所（国家白酒质检中心），江苏宿迁223800）

己酸菌培养过程中提高质量的新举措

司波，常春，姜雪

（宿迁市产品质量监督检验所（国家白酒质检中心），江苏宿迁223800）

己酸菌培养过程中，容易污染及发黑产生臭味。创造有利于己酸菌生长的环境及具有抑制杂菌生长的工艺条件，同时提高己酸菌培养液的质量及合格率，从而提高白酒质量及劳动生产率。

己酸菌；窖泥；黄水；香醅；高温接种

窖泥是浓香型白酒功能菌生长繁殖的载体，是生产浓香型大曲酒的基础。窖泥的微生物区系及有效成分含量与大曲酒的质量息息相关。老窖出好酒这已经是酿酒界不争的事实。窖龄越长，酒质越好。窖泥在长期的酿酒发酵过程中浸润渗入了越来越多的有机酸类、醇类等物质，以及特有的有益微生物区系。如果窖池窖龄短，没有充分老熟，其微生物含量就会相对很低，导致原酒中己酸乙酯含量较低，原酒口味寡淡，香味不足。窖泥的主要微生物功能菌——己酸菌培养技术在20世纪80年代已经进入实用阶段。但是怎样杜绝在大规摸生产中己酸菌培养液产酸低，颜色发黑产生臭味，同时提高己酸菌培养液的质量及合格率是大家一直不断探索的课题。我们通过进一步了解己酸菌的生长特性：其是适应土壤生长的微生物，属于兼性厌氧菌，以泥土中腐殖质、有效磷、酵母自溶物、以及氨态氮等为基本营养，具有耐热性生长代谢性能低等特点。其生长环境泥土水分＞40%，pH值5～7，为偏酸性环境。窖池底部栖息着大量的己酸菌，也证明窖池底部环境最适合己酸菌的生长，从而相对抑制部分微生物的生长。因此在己酸菌培养过程中我们有必要创造这样的培养条件。

1 材料与方法

1.1 富集培养材料与试剂

富集培养所需耗材：乙酸钠8 g，氯化镁200mg，氯化铵500mg，硝酸锰2.5mg，硫酸钙10mg，硫酸亚铁5mg，钼酸钠2.5mg，对氨基苯甲酸0.1mg，生物素0.005mg，pH7.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠25m L，含1%硫化钠、0.05%碳酸钠溶液20m L，蒸馏水1000m L。高压灭菌30m in备用。实验中所用试剂均为国产分析纯。

己酸菌菌种分离及扩大培养所需耗材：乙酸钠5 g、酵母膏1 g、磷酸氢二钾0.4 g、硫酸铵0.5 g、硫酸镁0.2 g、酵母粉2 g、蒸馏水1000m L。实验中所用试剂均为国产分析纯。

己酸菌大缸菌液培养所需耗材：醋酸钠0.3%，磷酸氢二钾0.02%、硫酸镁0.01%、硫酸铵0.03%、酵母粉0.1%、碳酸钙1%，以上所用试剂均为国产工业用产品。

1.2 仪器与设备

ZDX-35BI高压灭菌锅，上海精密仪器仪表有限公司；FA2004B电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HH.BII600型电热恒温培养箱，湖北黄石市医疗器械厂；HH-S4数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；SY-02型厌氧菌培养箱。

1.3 富集培养操作方法

取优质老窖泥2 g加入到装有100m L上述培养基液的细颈瓶中，在85℃恒温水浴中处理15m in，迅速冷却后补入上述高压灭菌30 m in冷却后的培养基，用2%的乙醇至瓶口下5 cm封口，放入真空干燥器抽真空0.07MPa于35℃恒温培养产气时止。

1.4 己酸菌菌种分离的操作方法

挑选产气旺盛的、培养基液定性分析确定为己酸，镜检观察菌体健壮带有芽孢运动的作为主要处理对象。将菌液上清液倒掉80%，将剩余部分在85℃恒温水浴中处理10m in，迅速冷却后，在无菌室补入上述高压灭菌冷却后的培养基并用1%经干热灭菌的碳酸钙、总容量2%的乙醇至瓶口下5 cm封口，放入真空干燥器抽真空0.07MPa于35℃恒温培养5 d。挑选产气旺盛的、培养液定性分析确定为己酸，镜检观察菌体健壮、带有鼓棰状芽孢运动的作为己酸菌菌种使用（注：抽样检测是用接种后留下的样品，避免取样过程造成污染）。

1.5 己酸菌菌种液的扩大培养操作方法

小三角瓶（100m L）、大三角瓶（1000m L）、卡氏罐（25 L）都采用己酸菌菌种分离用的培养基。由于培养基都经过高压灭菌及在无菌状态下接种，菌种质量基本能够得到保证。小三角瓶、大三角瓶、卡氏罐培养温度都为35℃，培养时间为5～7 d。

1.6 大缸菌液培养操作方法

（1）缸内放水前先将管内的存水放掉，以免己酸菌液在接触到较多的铁离子时产生硫化铁变黑，加入大缸内300 kg，称量醋酸钠1050 g，磷酸氢二钾70 g，硫酸镁35 g，硫酸铵105 g，酵母粉350 g，蒸汽至煮沸保持15m in。

（2）先将窖泥在水桶内用少量水浸泡揉碎。

（3）待降到85℃加入优质窖泥6 kg、经干热灭菌的碳酸钙3 kg、黄水30 kg、香醅6 kg、己酸菌菌种液50 kg、酒精6 kg，然后用75%酒精浸泡的塑料布封严，缸外用凉水喷淋降温。保持培养温度为33～35℃，培养7 d。

2 己酸菌液检测分析

2.1 己酸菌细胞数的检测方法

2.1.1 检测样本的制备

取己酸菌培养液2m L，用无菌水稀释一定的倍数（以计数板每小格4～5个较为合适，否则重新稀释）。

2.1.2 制片

将以上检测样本用干热灭菌过的吸管吸取1滴于计数板上，然后将盖玻片由一边向另一边轻轻压下，使盖玻片下不会产生气泡。

2.1.3 镜检计数

如果是25×16的计数板，数4个角上及中间的5个大格，即80个小格的细胞数。

计算方法：细胞数（个/m L）=80个小格的细胞数/80× 400×104×稀释倍数。

2.2 硫酸铜显色法检测己酸含量

取己酸菌培养液2m L，加2%硫酸铜溶液2m L，乙醚1m L摇动使其充分反应分层，上层呈现绿色而且颜色越深表示己酸含量越高（注：这只是常用的比较快捷的检测方法，平时结合己酸定量分析及色谱分析进行确定）。

3 结果与对比

3.1 新方法大缸己酸菌菌液与原方法的对比（见表1）

从表1可以看出，新方法大缸己酸菌菌液由于采用新的培养基配方，菌液中己酸菌数量、己酸含量明显高于原方法大缸己酸菌菌液，其菌体也明显健壮整齐。由于采用高温接菌，菌液合格率的提高也相当明显。

3.2 人工窖泥理化指标分析（见表2）

从表2可以看出，由于采用新方法大缸己酸菌菌液，新方法人工窖泥各项理化指标明显高于原方法建人工窖泥，由于优质窖泥、黄水、香醅提前在大缸培养基中使用，为己酸菌及其他有益细菌生长及提前适应创造了良好条件，新方法建人工窖泥与原方法相比质量明显提高。

3.3 新方法建人工窖泥池与原方法建人工窖泥池产酒己酸乙酯含量对比（见表3）

从表3可以看出，新方法建人工窖泥池由于其有益微生物含量特别丰富，其参与酯化作用的动力就特别充分，使原酒中呈香呈味物质增长明显，为原酒质量的提高起到了明显的作用。

4 小结与讨论

利用新的己酸菌培养方法既有利于己酸菌的生长，同时对于容易繁殖的酿酒有害微生物具有一定的抑制作用。窖泥、黄水、香醅的加入既补充了己酸菌所需的碳源、氮源、腐殖质等有效成分，同时又含有酿酒发酵过程中产生的酸类、酯类、醇类、还原糖、蛋白质等，为更加适应己酸菌的生长创造了条件，为己酸菌快速适应窖池环境奠定了基础，通过不断的探索及改良，窖泥质量得到很大的提升，对酿酒企业产品质量的提高创造了很大的空间。

New Approaches to Im prove the Culture of Caproic Acid Bacteria

SIBo,CHANGChun and JIANG Xue
(NationalQuality Testing Center for Baijiu,Suqian Institute of Product Quality Supervision and Testing,Suqian,Jiangsu 223800,China)

Contamination and blackening easily occur in the culture process of caproic acid bacteria which will result in foul smell.The establishment of the environment beneficial to the growth of caproic acid bacteria and the technical conditions inhibiting the grow th of hybrid bacteria may improve the quality and the passing rate of caproic acid bacteria culture liquid,and further improve liquor quality and increase labor productivity.(Trans.by YUEYang)

caproic acid bacteria;pitmud;yellow water;fermented grains;high-temperature inoculation

TS262.3；TS261.4；TS261.1

A

1001-9286（2017）02-0086-02

10.13746/j.njkj.2016323

2016-11-02

司波(1984-)，国家白酒质检中心大型仪器部部长，本科，工程硕士，工程师；常春（1986-），国家白酒质检中心，检验员；姜雪（1985-），国家白酒质检中心，技术研发部部长，工程师，从事食品检验工作多年。

优先数字出版时间：2017-01-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170104.1455.010.htm l。