我国猪博卡病毒的流行现状及检测技术

2017-01-31谢金文沈志强

养猪 2017年2期

关键词：特异性引物病毒

李娇，谢金文，李峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

我国猪博卡病毒的流行现状及检测技术

李娇1，谢金文2，李峰2，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪博卡病毒（PBoV）属于细小病毒科（Parvovirus）细小病毒亚科（Parvovirus）博卡病毒属（bocavirus），为无囊膜的单股DNA病毒，病毒粒子大小为25～30nm，呈正二十面体结构。病毒基因组全长5.2 kb，编码3个主要的开放阅读框（ORF1～3），其中ORF1编码非结构蛋白NS1，ORF2编码衣壳蛋白VP1和VP2，ORF3编码非结构蛋白NP1。根据非结构蛋白NS1的核苷酸同源性分为5个基因型（PBoV-1型、PBoV-2型、PBoV-3型、PBoV-4型、PBoV-5型）。该病毒于2009年被首次报道[1]，我国翟少伦等[2]于2010年首次在191份疑似患高热病的病料中检出PBoV，随后国内养猪密集地区相继检测出PBoV。目前国内对于该病毒的研究仍处于起步阶段，病毒的理化性质、致病机理、致病性尚不清楚，病毒的体外细胞培养系和动物模型尚未建立。笔者就目前国内PBoV的流行现状及检测技术进行综述，以期为我国PBoV的防控提供参考。

1 流行现状

1.1 病原学调查情况

PBoV自2010年首次在国内被检测到以来，在短短几年的时间内，在猪群中就有较高的流行率。Liu等[3]对辽宁、天津、河北、河南、山东5个省区采集的403份组织样品进行检测，PBoV平均感染阳性率为11.41%，其中以山东的感染率最高（41.86%），河北次之（20.8%），河南和辽宁的感染率分别为11.0%和10.0%，天津市的感染率最低（1.3%）。Zhai等[4]对采自浙江、江西、安徽、河北、河南、江苏、北京、上海、新疆9省市的组织病料样品进行检测，PBoV感染率在12.5%～88.9%之间。Shan等[5]对上海、江苏、安徽、山东、贵州的共计340份健康猪样品进行检测，PBoV感染率在45%～75%之间。胡军勇等[6]对湖北、湖南、河南省的79个规模化猪场进行流行病学调查，248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性，PBoV阳性感染率高达69.35%。Zhang等[7]对国内10个省份的166份样品进行PBoV的分型检测，结果PBoV-1、PBoV-2、PBoV-3、PBoV-4的感染率分别为28.9%、6.6%、19.3%和39.4%，说明中国猪群中存在多种基因型的PBoV感染。蔡雨函等[8]对四川省189份仔猪腹泻病料进行检测，PBoV阳性样品121份，阳性率达64.02%，121份阳性样品中有79份为PBoV 3/4/5型，29份为PBoV 1/2型，13份为PBoV 1/2型及3/4/5型混合感染，表明四川地区主要的流行毒株可能是PBoV 3/4/5型。邓波等[9]对上海市1 800份猪血清、45份猪粪便、27份猪鼻棉拭、9份高热病死猪内脏进行检测，阳性率依次为24%、30%、0%、67%，并且对6份PBoV阳性病料进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的检测，阳性率依次为83%、100%、0%、0%，表明上海市PBoV感染情况普遍存在，猪内脏中检出率较高，且春秋两季高发，仔猪比较易感，并与PRRSV、PCV2存在混合感染。以上流行病学调查资料共同表明，PBoV在国内猪群中流行广泛，感染率较高，且存在PBoV多种基因型的感染，以及PBoV与PRRSV、PCV2等疫病的混合感染，感染情况比较复杂。

1.2 分子流行病学调查情况

分子流行病学通过对病毒核酸序列或蛋白质结构构建遗传进化树，可在同一病毒种属内进行种系分析，研究一定时期内病毒的遗传变异和流行情况，为寻找病毒的传播途径以及制定不同地区不同时间的防控措施提供指导。郝飞等[10]根据GenBank收录的25条PBoV全基因或部分基因序列，利用DNAStar分析软件，通过Jotun-Hein算法，分别从PBoV的NS、NP、VP以及全基因序列进行相似性临近排组分析，并建立了系统发育进化树，发现PBoV基因较为离散，种属内的差异较大，大体可分为2个大支和若干遗传簇，不同的遗传簇所包含的毒株在核苷酸序列上存在着一定的差异，同支序列的分离株相似性较高，PBoV在进化过程中存在一定的地域差异性，推测PBoV在传播过程中可能发生了重组，从而产生了较大的变异。

2 检测方法研究进展

PBoV在临床中常常与PRRSV、PCV2、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等疫病混合感染，增加了PBoV临床确诊的难度，对于PBoV的确诊需借助实验室检测技术。过去对于动物病毒病的实验室检测技术一般都采用病毒的分离鉴定方法，但PBoV作为一种新发病毒，对其研究尚处于初级阶段，目前只有北爱尔兰科研人员利用猪原代肾细胞成功分离出PBoV的报道[11]，我国还未见PBoV成功分离的报道，至今尚未找到合适的PBoV体外细胞培养系和动物模型，故国内对PBoV的实验室检测技术研究主要集中在分子生物学和血清学检测方面，而且取得了较大进展。

2.1 PCR方法

PCR方法是目前最简单的分子生物学检测方法，该方法操作简单、检测快速、具有一定的敏感性，已被广泛应用于动物疫病的检测。叶星宇等[12]根据GenBank公布的PBoV的核苷酸序列，在其NP1保守区域设计1对特异性引物，经过PCR反应条件的优化，建立了检测PBoV的PCR方法，该方法检测猪瘟病毒（CSFV）、PPV、PRRSV、PCV2均为阴性，特异性好。该方法的敏感度可以达到58 pg/μL，敏感性高。该方法3次重复检测的结果完全一致，重复性好。对阳性扩增产物测序，与Gen－Bank公布的PBoV NP1序列同源性在97.3%以上，可靠性强。胡军勇等[6]也根据PBoV NS1基因序列设计1对引物，建立了检测PBoV的PCR方法，该方法能够从PBoV阳性样品中特异性地扩增出482 bp的片段，而对PPV、PCV2、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌的核酸样品均无非特异性扩增反应，该方法对PBoV的最低检测量为213.6拷贝，为PBoV临床诊断和病原学调查提供了一种检测技术。

2.2 多重PCR方法

多重PCR方法是在常规PCR反应体系中加入多对引物，实现多种病原核酸的同时鉴别检测，可应用于PBoV与其它致病原的鉴别诊断以及PBoV不同基因型的分型检测。付朋飞等[13]根据GenBank中登录的PBoV不同基因型序列和PCV2全基因组序列分别设计2对特异性引物，通过对扩增条件进行优化，建立了能够同时检测PBoV和PCV2的双重PCR方法，该方法可以同时扩增出PBoV（209 bp）和PCV2（476 bp）的特异性片段，而对PRV、PPV、沙门氏菌、大肠埃希氏菌DNA模板扩增结果均为阴性，对PBoV和PCV2的最低检出量均为100拷贝/μL，该双重PCR与单重PCR的检测符合率为100%。该双重PCR特异性强、重复性好、敏感性高，为PBoV和PCV2的快速鉴别诊断提供了有效的技术支持。焦洋等[14]根据GenBank登录的TGEV S基因序列、PEDV M基因和PBoV NP1基因序列，设计合成3对引物，对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增，通过优化反应条件，建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法，该方法检测猪A群轮状病毒（GAR）、PRRSV、PRV、PCV2均为阴性，对TGEV、 PEDV、PBoV核酸的最低检测限分别为35、20、10 pg。该方法可以在同一体系中同时检测3种病毒，大幅降低了检测成本，为TGEV、PEDV、PBoV感染的鉴别诊断提供了简便、快速、准确的检测方法。宏春慧等[15]分别根据PBoV-1型、PBoV-2型、PBoV-3型基因序列保守区域设计3对引物，通过引物浓度和退火温度等条件优化，建立了同时检测PBoV 3种基因型的三重PCR方法。该方法可以同时扩增出645 bp（PBoV-1型）、352 bp（PBoV-2型）和259 bp（PBoV-3型）的特异性片段，而对PEDV、TGEV、GAR、猪库布病毒（PKoV）、PCV2、CSFV、大肠埃希氏菌的检测均为阴性，最低检测限为8×10-7ng/μL，对临床样品进行三重PCR和单项PCR检测，二者符合率为100%，该方法的建立为PBoV 3种不同基因型的鉴别检测提供了有效手段。

2.3 荧光定量PCR方法

荧光定量PCR方法是指采用SYBR GreenⅠ荧光染料或荧光探针通过连续监测荧光信号的强弱变化来定量分析扩增产物的数量，进而实现对起始模板的准确定量。与常规PCR方法相比具有敏感性更高、适时定量、自动化程度高等优点。陈鹏强等[16]根据PBoV-5型NS1基因序列设计引物，建立了基于SYBR GreenⅠ检测PBoV-5的实时荧光定量PCR，该方法在3.64×102～3.64×107拷贝/μL范围内有很好的线性关系，检测猪圆环病毒（PCV1和PCV2）、PPV、猪输血传播病毒（TTV-1和TTV-2）的核酸均无阳性信号扩增，组内变异系数为0.35%～1.24%，组间变异系数为0.43%～1.46%。邓波等[17]根据PBoV序列，通过VP1和VP2基因设计引物和TaqMan探针，建立了检测PBoV的实时荧光定量PCR方法，该方法检测PPV、PRRSV、PCV2均为阴性，最低可检测到101拷贝/mL的阳性质粒，具有灵敏度高、特异性好和精确性高等优点，在PBoV的临床诊断、大规模临床样本检测中将具有广泛的临床应用前景。

2.4 LAMP方法

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种新兴的分子生物学检测方法，具有不需要特殊仪器设备、操作简单、检测快速等优点，但该方法的敏感性太高，已导致临床假阳性的检测结果。李彬等[18]从基因数据库中检索获得PBoV基因序列，通过DNAStar软件进行序列比对，获得PBoV特异性保守序列，通过LAMP引物设计软件（Primer Explorer software version 4.0）对该保守序列进行LAMP引物设计，获得4条特异性引物，经Mg2+浓度、反应温度、反应时间3个参数反应条件的优化，建立了检测PBoV的LAMP方法，该方法的灵敏度可达到检测10个拷贝的PBoV核酸，检测CSFV、PRRSV、PCV2、PRV均为阴性。该LAMP检测方法敏感性高、特异性强、操作简单、检测快速，已经组装了试剂盒并申请了国家专利，能够较好的满足PBoV现地检测的需要。

2.5 血清学方法

血清学检测技术或称免疫学检测技术是一种基于抗原抗体特异性反应原理，通过在抗原抗体上标记的放射线、荧光、酶等特殊物质作为探针来检测抗原抗体的体外免疫反应技术。张晶等[19]为研究PBoV VP1蛋白在血清学诊断中的作用，用DNAStar软件预测了PBoV NP08株VP1蛋白的主要抗原表位，确定1～34个氨基酸为优势抗原表位区，将其定向克隆至pET32a原核表达载体，转化BL21感受态细胞，利用IPTG诱导表达，获得了分子量为56.7 ku的重组蛋白VP1，Western blot鉴定表明，纯化后的VP1蛋白与PBoV阳性血清具有良好的反应性，用该蛋白包被ELISA反应板，检测10份临床感染PBoV的猪血清样品和3份未感染猪血清样品，结果表明其具有很好的特异性，不与未感染猪的血清发生反应，为进一步建立检测PBoV的血清学抗体诊断方法奠定了基础。李彬等[20-21]利用原核表达系统先后分别成功表达了PBoV NP1和VP2蛋白，利用镍离子蛋白纯化柱分别成功纯化了2个重组蛋白，Western blot结果显示，表达的VP2蛋白和NP1蛋白均能与His抗体发生特异性免疫反应，重组VP2蛋白和重组NP1蛋白均可以作为PBoV诊断抗原的候选蛋白，分别为建立检测PBoV NP1抗体和VP2抗体的血清学诊断方法奠定了基础。

3 结语

现阶段的流行病学调查证明，PBoV自2010年在我国被首次发现以来，其在国内猪群中感染率一直较高，且存在PBoV多种基因型的感染以及PBoV与PRRSV、PCV2等疫病的混合感染，感染情况比较严峻，应加强重视。对于PBoV的各种检测方法，PCR和多重PCR方法虽然操作简单、快速，但不能定量，且敏感性有限，容易漏检。LAMP方法虽然对仪器、试剂、操作人员的要求较低，更适合基层应用，但敏感性太高，易污染。荧光定量PCR方法弥补了常规PCR方法的缺点，但该方法对仪器、试剂、操作人员的要求均较高，有条件的实验室可选择使用。血清学方法操作简单、检测快速、高通量，适合大规模样品检测，虽然国内还没有商品化的血清学检测试剂盒，但其将具有广阔的开发与应用前景。综合判断，各种检测方法均具有各自的优缺点，不同单位可根据自身的情况选择适合自己的方法。相信随着分子生物学和免疫学技术的不断发展，以及PBoV基础性研究的不断深入，PBoV的各种检测方法将会得到进一步发展与完善，从而为PBoV的临床诊断与流行病学调查提供技术保障。

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（编辑：郭玉翠）

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