重组酶聚合酶扩增技术及其在病毒性猪病快速检测中的应用

■文/诸城市畜牧兽医管理局 庄夕栋

重组酶聚合酶扩增技术及其在病毒性猪病快速检测中的应用

■文/诸城市畜牧兽医管理局 庄夕栋

重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是近年来建立起来的一种新的核酸恒温扩增技术，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、在短时间内快速扩增出目的片段等优点，在动物疾病早期诊断、现地检测、进出口快速检疫等方面具有良好的应用前景。文章综述了RPA技术及其在病毒性猪病快速检测中的最新应用研究进展，以期为更好地防控猪病提供参考。

重组酶聚合酶扩增技术；猪病；检测

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是近几年出现的有望替代PCR的新的核酸扩增技术。RPA技术由Piepenburg等[1]于2006年创立，该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，体外模拟生物体内DNA复制，在恒温条件下即可对目的片段进行扩增[2]，特别适用于快速检测、体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域[3]，已被成功应用到多种病原的快速检测上。本文现将RPA技术及其在病毒性猪病快速检测中的最新应用综述如下。

1 RPA技术

RPA该技术主要依赖于3种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶[4]。这3种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。反应过程中不需要模板链的热变性，可以在恒定的低温条件下10～20min内快速扩增目的DNA或者RNA[5]。随后，英国TwistDx公司开发出了商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用[6]。与传统聚合酶链式反应(PCR)相比，RPA技术具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单、检测成本低、结果确实可靠、可制作成侧流层析试纸条(LFD)等优点，适用于现场快速检测，有望替代PCR。目前，RPA技术已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用[7]。

2 RPA技术在病毒性猪病检测中的应用

2.1 口蹄疫

口蹄疫(Foot and Mouse Disease，FMD)是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)引起的一种偶蹄动物共患的急性、热性、高度接触性传染病，被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病。Abd等[8](2013)将RPA基础反应体系中加入反转录酶，在RPA基因扩增与荧光检测仪中进行RT-RPA，应用到FMDV的检测当中，可以检测到FMDV的所有的7个血清型，而且各型之间没有发生交叉反应，特异性强，灵敏性高。Amer等[9](2013)研发出一种可以在4～10min内检测到FMDV的实时RT-RPA，灵敏度高达98%。此技术成功应用于当年埃及的口蹄疫大暴发时期，有效抑制了疫情的蔓延。王红梅等[10](2016)利用最新的RPA技术，结合LFD方法，建立了可用于O型、A型和AsiaⅠ型FMDV的通用型和血清型分型的现场快速检测技术。在25min内即可完成RPA反应，灵敏度可达到1TCID50。杨洋等[11](2017)根据O型FMDV ON毒株3D基因保守区域设计引物和探针，建立了实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(real-time RT-RPA)检测方法，在40℃恒温条件下20min内可快速、特异地检测FMDV。利用该方法对采集的临床样品进行检测，检测结果与荧光定量RT-PCR检测结果具有100%的符合率。RPA技术为FMDV的现场检测提供了一种灵敏、可靠的新方法，为口蹄疫疫情的诊断及预报提供了技术支持。

2.2 猪细小病毒病

猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，PPV感染主要引起胚胎和胎儿死亡、重吸收、流产、木乃伊胎等，但母猪不表现明显的症状。Yang等[12](2016)研制了检测PPV NS1基因的荧光定量RPA和LFD方法，最低可分别检测到300和400个含NS1基因的重组质粒，平行检测101份病料和27份阴性样品，荧光定量RPA和LFD与荧光定量PCR结果符合率分别为94.4%和100%。

2.3 猪圆环病毒病

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)是引起仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)为代表的系列疾病的病原，主要侵害6～12周龄的仔猪。PCV2的感染呈世界性分布，已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。PCV2感染可以导致动物免疫抑制，从而增强对其他多种病原体的易感性，使病情更加复杂化。Wang等[13](2016)建立了检测PCV-2的实时荧光定量RPA方法。该方法最低可检测100个PCV-2基因组，灵敏度与荧光定量PCR相同，较普通PCR提高了10倍。平行检测48份病料样品，RPA与荧光定量PCR结果一致，与普通PCR符合率为93.7%(45/48)。

2.4 猪蓝耳病

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)又 称 猪 蓝 耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的传染病，在世界范围内的猪场广泛流行，给养猪业造成了巨大经济损失。Yang等[14](2016)研制了检测高致病性猪蓝耳病病毒(HPPRRSV)的荧光定量RPA方法。该方法最低可检测到70个目的基因的重组质粒，平行检测125份临床样品，荧光定量RPA与荧光定量PCR检测结果敏感性和特异性分别为97.6%和100%。

2.5 猪流行性乙型脑炎

猪流行性乙型脑炎又名日本乙型脑炎，是由日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的一种急性人兽共患传染病。猪主要特征为高热、流产、死胎和公猪睾丸炎。梁辉[15](2016)建立了JEV的RT-RPA-LFD的快速检测方法，20～25min即可获得稳定、准确的检测结果，具有耗时短、操作简便、结果判定准确直观的优点，适合用于JEV现地检测和在基层推广应用。而且T-RPA-LFD检测方法可以用于多种JEV分离株的检测，方便携带，适用性强。

2.6 其他猪病

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。临床症状与猪瘟极其相似，以高热、皮肤发绀、内脏器官严重出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征。本病传播快、致死率高，对养猪业危害巨大，是我国一类动物疫病和OIE规定的必须报告的动物疫病。王建昌等[16](2016)基于ASFV VP72基因保守序列设计并合成引物，建立了ASFV的RPA检测方法，在38℃水浴锅中恒温反应30min，即可实现对目的片段的有效扩增，为ASFV的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus，SVV)又 称 为 Senecavirus A(SVA)，是猪原发性疱疹病(Swine Idiopathic Vesicular Disease，SIVD)的主要病原，可感染猪，引起类似FMDV感染造成的水疱性病变。SVV感染猪群后，尽管不会造成与FMDV相同的较大政治、经济损失，但所引起的水疱性病变与口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎、猪水疱疹等造成的病变相似，给临床鉴别诊断造成了一定的困难。樊晓旭等[17](2017)利用RPA技术，针对SVV 3D基因设计引物和探针，建立了实时荧光RPA方法，在40℃、10min内检测的最低浓度为28拷贝/μL。该等温快速扩增方法为猪群出现水疱性疾病的鉴别诊断提供了技术支持，对及时采取适当防控措施具有重要意义。

3 前景与展望

我国养猪业规模巨大，产值高，但是各种病害不断出现，严重制约着我国畜牧业的健康发展。近些年来，随着现代免疫学和分子生物学技术的不断创新，动物病原的检测方法取得了前所未有的发展，但各种方法或因成本过高难以推广，或因灵敏度过低无法达到检测要求，或因耗时耗力不实用。RPA结合了血清学和分子技术的优点，并克服了两种方法的缺点，是一种简单、快速、性价比高的诊断工具，在动物疾病早期诊断、现地检测、进出口快速检疫等方面具有巨大的应用前景和市场[18～20]。以RPA技术为基础建立的RPA-ELISA、on-chip RPA等扩增技术可以高通量自动化检测多种病原体，提高检测效率[21]。另外，RPA技术在癌症突变检测、遗传病的定期和快速普查、动物食品安全卫生、转基因成分检测等领域也具有广阔的应用前景[22～25]。虽然目前RPA技术的检测成本高于PCR等其他核酸扩增技术，但随着RPA技术的进一步发展、完善以及生产工艺的改良，RPA技术有望成为常规的快速诊断手段，并在分子生物学、医学、遗传学等各个研究领域得到更加广泛的应用。■

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