葡萄品种鉴定技术及在遗传多样性领域的应用

孙明君，汪东风，高宏伟，陈洪俊，朱水芳，梁成珠

（1中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266000；2山东出入境检验检疫技术中心，山东青岛266002；3国家质检总局国际检验检疫标准与技术法规研究中心，北京100000；4中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所，北京100000）

葡萄品种鉴定技术及在遗传多样性领域的应用

孙明君1,2，汪东风1，高宏伟2，陈洪俊3，朱水芳4，梁成珠2

（1中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266000；2山东出入境检验检疫技术中心，山东青岛266002；3国家质检总局国际检验检疫标准与技术法规研究中心，北京100000；4中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所，北京100000）

葡萄品种的鉴定是葡萄种质资源研究和新品种保护的基础。为了对葡萄种质资源的安全引进和输出提供技术保障，本文归纳了葡萄品种鉴定中常用技术及其在遗传多样性领域的研究进展，总结了在葡萄品种鉴定过程中存在的问题，分析了分子技术在葡萄品种鉴定中的发展趋势，并对今后品种鉴定工作进行了展望。

葡萄；品种鉴定；种质资源；遗传多样性；分子标记

0 引言

葡萄属于葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis L.)，为落叶藤本植物，是世界最古老的植物之一。葡萄属分为真葡萄亚属(Subgen Euvitis Planch)和圆叶葡萄亚属(Subgen Muscadinia Planch)。葡萄是世界性的重要经济水果，其产量约占全世界水果产量的25%。目前，已发现的葡萄属种质资源有70多个种，已登记的品种有16000个，广泛分布于温带和亚热带地区[1]。葡萄属植物起源广泛，加上人为引种交换、育种、营养系选种等活动的影响，使得葡萄品种繁多，基因型丰富多样，而且随着栽培范围的扩展，品种不断增加，形成了诸多各具地方特色的品种群。但是，这种变异丰富、品种繁多的现象，在长期引种栽培过程中，势必造成大量的同名异物和同物异名，使得葡萄品种鉴定十分困难[2]。

物种资源的保护和利用是生物多样性公约的重要内容，国际社会正在探讨制定物种资源获取和惠益分享国际制度，生物物种资源的检验检疫将是实施相关制度的技术保障。世界葡萄（酒）的著名产地对葡萄品种的、保存、研究是非常重视。作为重要的生物物种资源，葡萄品种资源的引进和输出也面临严峻的保护和利用问题。从国外引种时，出口国家对该品种中的每个品系使用代码标识，同一品种不同品系的葡萄在酿酒品质上差异很大。亟需相关的鉴定技术以便进行种质资源的溯源，这对于后续公正、公平的分享物种资源利用所产生的惠益具有重要意义。葡萄品种鉴定的意义主要体现在3个方面：第一，为葡萄的引种企业提供鉴定服务；第二，为葡萄种植企业的后续选育、酿造提供品系鉴定的技术支撑；第三，为中国酿造葡萄的国际交流通搭建平台。本文总结了主要的葡萄品种鉴定技术及分子技术在葡萄品种鉴定中的发展趋势，详细介绍了葡萄品种鉴定技术在遗传多样性研究中的应用进展，对于建立口岸葡萄物种资源的查验方法和标准提供技术支撑，为种质资源的安全引进和输出提供技术保障，为葡萄种质资源的出入境监管提供技术参考。

1 葡萄品种鉴定技术研究进展

1.1 形态学鉴定

刘崇怀等[3]对《中国葡萄志》描述的38个中国葡萄属野生和1个栽培品种，按照《葡萄种质资源描述规范和数据标准》的要求，对18个描述符用代码量化并进行聚类分析，根据形态特征的相似程度，将中国葡萄属野生种和欧亚种划分为8个组和5个亚组。宋真等[4]以成熟叶片为基本材料，运用国际葡萄与葡萄酒组织形态分类方法及技术开发了基于葡萄叶片数字图像的葡萄品种自动识别软件，共测试17种酿酒葡萄和3种野生葡萄，识别率达87%。宋军阳等[5]对原产中国的野生葡萄种和部分栽培品种共13个种30个株系（品种）的花粉形态进行观察研究，结果表明，除欧美杂交种巨峰葡萄花粉粒为四沟孔型外，其他野生葡萄、欧洲葡萄品种花粉粒均为三沟孔型。

1.2 生物化学鉴定

1.2.1 同工酶鉴定 崔辉梅等[6]对3个葡萄品种茎尖愈伤组织诱导苗的超氧化物歧化酶(SOD)同工酶分析，为体细胞无性系变异在品种改良中的应用提供了依据。吕秀兰等[7]采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，分析了22个葡萄品种的叶片中过氧化物(POD)同工酶酶谱特征。结果表明，22个品种共电泳出6种过氧化物同工酶酶带，酶谱类型17种，表明POD同工酶酶谱不能将葡萄品种鉴别开来，每种过氧化酶酶谱类型具3～5条酶带。Blein等[8]在研究葡萄必须发酵过程酵母蛋白质组变化产生不同适应性反应中发现，在葡萄糖发酵途径同工酶没有发生共变。S.cerevisiae和S.uvarum中最丰富的同工酶并不相同，这种现象在2个同工酶家族（PFK1/PFK2和TDH1/TDH2/TDH3）中表现显著。结果表明这2个品种利用不同类型同工酶进行葡萄糖发酵。

1.2.2 蛋白质标记 张玉洁等[9]对葡萄叶片中总蛋白质的双向电泳技术体系进行了初步探讨，得到较为理想的双向电泳分析结果。黄静等[10]通过双向电泳获得大叶蛇葡萄活性成分蛋白质表征图谱，为从分子水平研究大叶蛇葡萄活性成分蛋白表达奠定了良好的基础。Maria等[11]采用差异蛋白质组学方法，通过凝胶电泳结合串联质谱进行鉴别和量化156个绿色浆果和61个成熟浆果的差异蛋白表达，对于研究葡萄的生物学功能、浆果发育和品质特征起到重要作用。

1.3 DNA指纹图谱技术

DNA分子标记的鉴定方法是通过反映不同植物品种DNA水平上的差异而进行基因型鉴定和纯度分析的。目前已有很多技术成熟的DNA指纹图谱的鉴定方法，如RAPD、SSR、ISSR等DNA标记，具有操作简单易行、方便性好等优点，并有应用于植物品种鉴定的优势。

1.3.1 RFLP标记 Zhou等[12]从具有灰霉症状的鲜食葡萄分离得到的75珠葡萄孢，通过其在马铃薯葡萄糖琼脂(20 C)培养基上表现出的特征用3个核基因(G3PDH,HSP60,RPB2)序列进行系统发育分析。根据葡萄对环酰菌胺的敏感性及葡萄RFLP基因的单体型和致病性对所分离的不同种类葡萄孢进行比较。研究表明B.sinoviticola与鲜食葡萄B.cinerea属同一物种。

1.3.2 RAPD标记 Kang等[13]对37个葡萄品种进行RAPD指纹识别，得到了充足的多态性来区分葡萄品系，这些标记物成为葡萄品系鉴定中一个快速、可靠的工具。Fan等[14]通过18对序列相关扩增多态性引物组合来评估126个来自5个不同地理种群的华北葡萄独立样本的遗传多样性，分类结果几乎与种群的地理分步一致。侯鸿敏等[15]以起源于中国的野葡萄12个种23个珠系、欧美杂种6个品种、河岸葡萄3份、15个欧洲葡萄品种共47份材料为试材，采用RAPD技术对葡萄属植物种质资源遗传多样性进行研究。结果表明，欧洲葡萄、欧美葡萄杂种、河岸葡萄与中国野葡萄亲缘关系较远；在中国野葡萄中，山葡萄与其他种亲缘关系较远，刺葡萄次之。张剑侠等[16]以抗寒性存在差异的83份葡萄种质及3个杂交组合为试材，进行了中国野生葡萄抗寒基因RAPD标记的研究。通过对110个随机引物的筛选，获得了2个与中国野生葡萄抗寒基因相连锁的RAPD标记，可用于葡萄抗寒育种的早期分子标记辅助选择。于华平等[17]针对RAPD技术的特点及其实际应用中易出现稳定性的问题，以葡萄等7种果树的不同品种为试材，对RAPD技术在鉴定果树品种中的科学性进行了技术上的验证与分析。结果表明，理想的反应条件能够保证RAPD技术具有很好的稳定性，是适用于鉴定果树品种的简易与理想的DNA分子标记技术。

1.3.3 AFLP标记 Marián等[18]通过微卫星和标准AFLP分析手段对加利西亚（西班牙西北部最重要的本土葡萄品种）种质资源进行分子识别及对AFLP分析葡萄指纹的方法有效性进行评估。微卫星分析结果与数据库相一致，并首次提出了应用这种方法分析葡萄品种的分子特性。唐美玲等[19]通过AFLP分子标记方法，应用64对引物组合对山葡萄雌花、雄花和两性花植株基因池进行筛选。对已知性别的85份山葡萄种质进行盲测，准确率达到97.6%。

1.3.4 ISSR标记 王蕾等[20]利用ISSR标记和叶绿体DNA非编码区分析36种葡萄种质的遗传多样性和系统发育关系，为葡萄种质资源的理论和应用提供了有价值的信息。赖呈纯等[21]利用ISSR分子标记技术对95份葡萄品种（系）资源进行遗传多样性和亲缘关系分析。通过聚类分析将95份葡萄资源划分为3大类，分别为欧亚种、欧美杂种和东亚种群，与葡萄传统分类结果一致。李琳等[22]利用ISSR标记对24份葡萄材料进行了基因组多态性分析。结果表明，美洲杂交种与欧美杂交种、欧亚种葡萄的亲缘关系较远，欧美杂种与欧亚种葡萄之间亲缘关系较近。崔鹏等[23]利用ISSR标记研究南方45个葡萄主要栽培品种的遗传多样性和亲缘关系，明确了遗传背景。

1.3.5 SSR标记 Sana等[24]用9个核微卫星标记物来鉴别35个野生葡萄品种并探查了突尼斯西北部64个栽培品种。基因型分析表明，突尼斯野生和栽培样品均保持较高水平的基因变异。栽培和野生型之间的低水平基因流动表明，多数栽培品种并不是直接源于当地野生品种而可能因不同地区自然杂交产生。Natasa等[25]用11个微卫星标记对38个斯洛文尼亚当地品种进行基因分型和遗传关系评价，表明斯洛文尼亚葡萄品种在欧洲葡萄种质资源中呈现多态性和高水平遗传多样性，揭示了与克罗地亚品种关系最近，与法国关系最远。Anna等[26]通过13个微卫星标记对阿普利亚地区45个葡萄品种分型，并通过与阿普利亚及周边地区栽培品种的形态学特征进行对比，揭示了所发现新的同物异名是源于其他地区因早期殖民地和历史上地中海贸易路线的建立而移植传入的传统栽培品种。Goran等[27]用11个微卫星标记鉴别76个达尔马提亚本地葡萄品种，所发现的12个同物异名与之前的基因型进行比较，表明该现象源于同周边国家的葡萄品种交换。遗传距离分析显示存在5个葡萄种群并确认了几个独特的葡萄基因池。Dániel等[28]用14个微卫星标记对密苏里地区7个沙地葡萄种群进行基因分型，评估等位基因多样性、杂合性及种群结构不同水平下的遗传分化。发现沙地葡萄与欧亚种葡萄及其他异型杂交被子植物在遗传多样性方面有诸多相似，明显的区分密苏里州和俄克拉荷马州的种群，推断种群分化和遗传漂变是沙地葡萄的固有特征。Francois等[29]采用微卫星分析对希腊葡萄基因资源特性进行了研究，准确鉴别了希腊栽培葡萄品种并以网络数据库的形式收集了可用的葡萄品种学信息及分子数据。Emilia等[30]采用微卫星分析了西班牙西北地区新的同物异名和异物同名葡萄品种，研究中用8对微卫星证实加利西亚存在2个葡萄种群。Pilar等[31]研究了1993年以来伊比利亚半岛西北地区种植的22个古老葡萄品种，通过成熟叶片葡萄品种学特征及10对微卫星标记的分析评价表型和基因型变异，对当地古老葡萄品种生物多样性的保护具有重要意义。Hong等[32]将葡萄表达序列标签应用于基因分型和遗传映射，通过分类分析将6447个ESTSSR标记物缩减到1701个不重复序列，并进行葡萄的多态性和杂合性分析。这些EST-SSR功能性标记物对葡萄分型与遗传映射是一个有益的补充。CLAIRE等[33]从5个不同葡萄属跨域25个品种评价9个位点的可转移性。调查显示用衍生葡萄单一序列重复位点研究葡萄种群是可行的，这些高信息位点在未来葡萄保育研究中将发挥重要作用。Summaira等[34]首次使用基于DNA简单重复序列标记元件鉴定北美麝香葡萄栽培及杂交品种。14个SSR标记物共鉴定57个品种，通过比较亲本与后代共用等位基因来验证指纹图谱。对北美麝香葡萄品种多样性的保护起到一定作用。

1.3.6 SNP标记 Sara等[35]首次通过RNA测序深入了解单核苷酸多态性、物种变异及植物发育阶段转录组在葡萄浆果发育过程中的基因表达。在葡萄亲缘关系推定过程中SNP是一个强大的工具。llaHasna等[36]通过SNP分析鉴定伊比利亚半岛葡萄布兰卡的遗传网络，结果表明这个栽培品种在葡萄栽培地域存在相关影响，葡萄牙与西班牙的葡萄栽培之间存在联系。Michela等[37]通过SNP构建基于锚定细菌的人工染色体邻接片段的葡萄遗传连锁图。通过数据库添加SNP标记物引入多态性，显著提高谱图量级，对以后在研究葡萄结构和功能基因组、遗传改良方面提供相关帮助。Katie等[38]开发了一种称为HetMappS的模块化方案，解决了采用基因序列分型(GBS)建立遗传谱图时产生数据丢失和杂合复杂化问题，在高度杂合物种基因映射中有更广泛的应用。Francesco等[39]通过22个常见微卫星位点和384个单核苷酸多态性对2273个葡萄品种的分子多样性类型进行研究。通过比较物候与遗传的核心种质，表明SNP保留更多的遗传多样性同时保留相似的表型变异。Sean Myles等[40-41]开发启发式算法调用SNP数据，证实了SNP矩阵可提供足够的分辨率在葡萄品系间、栽培和野生品种间甚至多样化野生品种间进行区分。Gabriella等[42]通过葡萄18K SNP矩阵分析71个格鲁吉亚地区葡萄品种并调查遗传多样性水平。通过遗传结构与多变量分析得到的分类学状态与品种地理起源结论相一致。遗传多样性结构类型证明葡萄的驯化对格鲁吉亚地区作物的进化做出了贡献。Allison等[43]使用杂交强度数据降低了偏差的影响。应用SNP基因分型和葡萄9K SNP矩阵得到的杂交强度数据，确定了偏差的影响并重建葡萄品种间进化关系，证明用杂交强度重建系统发育过程降低了偏差，比基因型调用的系统发育更准确。

2 分子技术在葡萄品种鉴定中的发展趋势

经过10多年的系统研究和检测实践，在品种鉴定中逐渐实现了DNA指纹技术的升级和检测该体系的标准化，从最初使用RAPD标记技术到目前，基于SSR标记技术的检测体系日趋成熟，同时开始探索开展第三代分子标记SNP技术在葡萄品种鉴定中的应用研究。分子鉴定技术和理念的提升主要在以下3个方面：（1）从RAPD标记到SSR标记的技术提升；（2）从SSR标记到SNP标记的技术探索；（3）从非功能标记向功能标记的转变。

DNA分子标记技术的开发，是近年来分子生物学领域研究的热点。随着分子生物学理论与技术的迅猛发展，人们必将不断地开发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记。当前，分子遗传标记的发展呈现出以下5个趋势：（1）对现有遗传标记技术进行优化与集成，降低检测成本，提高检测效率，组合已有标记技术，同时提高标记的靶向性，使反映的信息专一性更加突出。（2）充分利用基因组结构的共性特征开发新标记，如重复序列、散在保守序列、新基因家族、启动子保守序列等，利用基因和基因内部模块“界标”保守序列，挖掘并利用基因组中编码元件与非编码序列的保守特征，从而发现更多更稳定、效应更显著的分子标记。（3）进一步开发揭示新遗传变异类型的标记，如表观遗传差异、表达丰度差异、表达模式差异等。（4）标记开发向高通量、集成式、自动化方向发展，如SNP芯片、变性高效液相色谱DHPLC、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF)等。（5）同时揭示多层次信息的复合标记，从基因组→转录组→蛋白组→代谢组→表型组，各层次信息的不平衡性决定了仅用单层次标记的局限性，使用多层次的标记，更能展示基因的表达调控方法和作用。

3 展望

目前，中国葡萄种植业已跨入世界先进行列，葡萄相关产业被列为中国“十二五”重点发展的农业产业，葡萄种植面积进一步扩大和下游产业发展对葡萄的引种、育种提出了更高更丰富的要求。葡萄品种繁多，后经过长期的引种、驯化、育种和营养系选中，形成了各具特色的栽培品种，使得葡萄品种资源不断丰富。作为重要的生物物种资源，引种、检验检疫、新品系开发过程中经常遇到的品系鉴定问题，葡萄引进和输出也面临严峻的保护和利用问题。

葡萄品种鉴定过程中存在的问题主要有：（1）从国外引种的酿造葡萄种质时，出口国家会告知中国企业出口的葡萄的品种，但是对该品种中的每个品系使用代码标识，同一品种不同品系的葡萄在酿酒品质上差异很大。（2）中国企业对所进口的葡萄苗无法鉴定真伪，这是目前葡萄引种企业急需解决的问题。（3）世界主要的酿造葡萄生产国，如法国、意大利等，都有完备的葡萄品系鉴定的技术；但是中国的葡萄种植业没有此类技术。因此中国酿造葡萄种植企业无法在国际上平等评判葡萄品系。葡萄种植企业后续的种质资源交流无法有效展开，酿造企业控制葡萄酒的稳定风味存在比较大的困难。

葡萄品种鉴定经历了从形态学到分子生物学，从外部到内部的过程。几种遗传标记在不同的应用中均有自身的优缺点。（1）形态学标记一直是葡萄品种鉴定及葡萄属植物分类最常用的方法。（2）细胞学鉴定以染色体为基础，能一定程度反映葡萄各品种间的遗传差异。（3）同工酶鉴定速度快、操作简便，但作为基因表达的产物易受环境因素的影响。（4）就常用的分子标记RAPD、AFLP、SSR、ISSR而言，RAPD由于重复性差、不稳定导致其分析结果不理想；AFLP稳定可靠，可用来增加遗传连锁图谱的密度以构建高清晰的图谱，但由于其成本高，程序繁琐，对DNA质量要求高，在分析大量群体时很不方便；而SSR标记由于在基因组中广泛分布，重复性高，多态性丰富，对DNA质量要求低，更适于检测大量群体，虽然其必须采用特异引物进行PCR检测，但可以应用SAM、STMP、搜索数据库等进行SSR引物的查询；ISSR较SSR更简单、快速、便宜，两者目前都是应用较多的分子标记方法，也是进行大量DNA指纹分析、基因多样性和种质资源评价中较好的技术方法。对于难以鉴定、亲缘关系很近的品种或一些芽变品种，需要综合形态学、生物化学、分子标记技术等多种方法进行鉴定。一些新开发出的分子标记在葡萄上还鲜见应用，随着技术和设备的进步，有望在今后的鉴定工作中发挥至关重要的作用。

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Identification Technology of Grape Variety and Its Application in Genetic Diversity Study

Sun Mingjun1,2,Wang Dongfeng1,Gao Hongwei2,Chen Hongjun3,Zhu Shuifang4,Liang Chengzhu2
(1Institute of Food Science and Engineering in Ocean University of China,Qingdao 266000,Shandong,China;2Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center,Qingdao 266002,Shandong,China;3General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine Inspection and Quarantine International Standards and Technical Regulations Research Center,Beijing 100000,China;4Institute of Animal and Plant Quarantine Inspection and Quarantine Institution in China,Beijing 100000,China)

Identification of grape varieties is a fundamental work for germplasm resources research and new varieties protection of grape.In order to provide technical support for the safety input and output of grape germplasm resources,the common technology in identification of grape varieties and its research progress in genetic diversity were summarized in this paper.The problems existing in the process of grape variety identification were summarized.We also analyzed the development trend of the molecular techniques in grape variety identification and forecasted varieties identification in future work.

Grape;Variety Identification;Germplasm Resources;Genetic Diversity;Molecular Markers

S-1

A论文编号：casb17010012

国家质检总局科技计划项目“酿酒葡萄品系鉴定研究”(2015IK214)。

孙明君，男，1986年出生，在职研究生，研究方向：分子生物学。通信地址：266002青岛市南区瞿塘峡路70号山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，Tel：0532-80885661，E-mail：522302003@qq.com。

陈洪俊，男，1961年出生，研究员，博士，研究方向：植物保护、检疫性有害生物鉴定和有害生物风险分析。通信地址：100000北京市朝阳区西坝河东里18号国家质检总局标准法规研究中心，Tel：010-84603939，E-mail：chenhj@aqsiq.gov.cn。

2017-01-16，

2017-02-22。