断奶仔猪副猪嗜血杆菌分离鉴定与药敏试验

许英民

（黑龙江省铁力市兽医专家门诊 黑龙江伊春 152500）

断奶仔猪副猪嗜血杆菌分离鉴定与药敏试验

许英民

（黑龙江省铁力市兽医专家门诊 黑龙江伊春 152500）

黑龙江省铁力市某原种猪场，有 216 头断奶仔猪，对其中患病仔猪进行临床及剖检的观察疑似副猪嗜血杆菌感染对该病例进行详细分离，通过细菌分离形态培养、生化试验、PCR 鉴定和药敏试验等，确定该分离菌株为副猪嗜血杆菌。测定该临床上常用抗菌药物对分离菌株的敏感性，结果显示，对头孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、头孢噻肟敏感，对头孢噻吩、氨苄青霉素、新霉素、头孢三嗪等 8 种药物耐药性，说明分离菌株抗药性比较严重。所以，提示临床防治该病时，应根据药敏试验结果进行防治。

断奶仔猪；副猪嗜血杆菌；分离鉴定；药敏试验

副猪嗜血杆菌病又称猪多浆膜炎综合征、或称猪纤维蛋白性浆膜炎和关节炎、革拉泽氏病，是由副猪嗜血杆菌（H.parasuis）引起的，在临床上以体温升高、关节肿胀、呼吸困难、多发性浆膜炎、关节炎和高死亡率为主要特征的传染病，危害仔猪和保育猪的健康。尤其是在经高致病性蓝耳病等免疫抑制性疫病发生并引起免疫功能下降后，副猪嗜血杆菌病更为严重，使猪场蒙受更大的经济损失。副猪嗜血杆菌可以影响2周龄至3月龄的仔猪和保育猪，多发生在断奶前后和保育期的猪，一般常见 5～7周龄的猪，死亡率一般在 15～19%，严重时可达 50%左右。最近笔者在某原种猪场进行诊断，对该场断奶仔猪发生的疑似病例，进行菌株的分离鉴定，为该病的防治提供依据。

1 材料

1.1 病料来源

在黑龙江省铁力市某原种猪场出现的副猪嗜血杆菌病疑似症状中，采用无菌采集病死断奶仔猪的心、肝、脾、肺和淋巴结等器官组织和关节积液。

1.2 主要仪器

高压灭菌器、生化培养箱、超净工作台、显微镜、冰箱、常用玻璃器材等。

1.3 主要试剂

副猪嗜血杆菌标准抗血清，购自中国兽医药品检查所；麦康凯琼脂、普通营养琼脂、鲜血琼脂、伊红美兰琼脂、普通肉汤、生化发酵管、药敏纸片等，均由我们实验室提供。

1.4 实验动物

试验小白鼠购自小动物饲养场，断奶仔猪由黑龙江省铁力市某原种猪场提供。

2 方法

2.1 涂片镜检

用病死断奶仔猪的肝脏、心血、关节积液，分别涂片或沫片，革兰氏染色，镜检。

2.2 细菌分离培养

取病死断奶仔猪的肝脏、心包液、脑组织、关节液、分别接种普通营养琼脂、巧克力琼脂，鲜血琼脂和麦康凯培养基上，经 37℃培养 24～48h。再挑取平板上针尖大小、透明的小菌落，划线于巧克力琼脂平板上。挑取菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态。

2.3 生化试验

将分离到的纯培养菌株分别接种于蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蛋白胨、山梨醇、甘露醇、尿素酶生化鉴定试管内，每个试管中加入 1μm0.3%NAD（烟酰胺嘌呤二核苷酸），置于 37 ℃恒温生化培养箱内培养 24h, 待观察生化反应。

2.4 PCR鉴定

根据有关文献合成下列引物，即 P1：5′-TATCGRGAGATGAAAGAC-3,P2：5′ -GTAATGTCTAAGGACTAG-3′ ,P3：5′-CCTCGCGGCTTCGTC-3′ ，扩增产物为 1090bp 左右的片段，1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，在凝胶成像系统下观察检测结果。

2.5 药敏试验

按 K-B 纸片扩散法将被检细菌涂布接种于普通琼脂平板上，间隔一定距离贴上各种药敏试纸，于 37 ℃培养 16～18h 后，观察结果。

3 结果

3.1 病料检查

病料涂片检查，采用无菌操作取病死猪的肝脏、心包液、脑组织、关节液涂片，革兰氏染色，镜检，可见长丝状、球状的细菌。

3.2 细菌分离与培养

可观察到在巧克力琼脂平板上长出针尖大小、无色透明、光滑湿润、边缘整齐而呈圆形的菌落。取菌落涂片，用革兰氏染色，可见长丝状、杆状、球状等多形态的短小革兰氏阳性杆菌，多单个存在或呈短链状排列。与直接涂片镜检的结果相同。另挑取该菌落接种于兔血琼脂平板上，再用金黄色葡萄球菌点种，呈现“卫星生长”现象。

3.3 生化试验

分离到的菌株能发酵蔗糖、麦芽糖、葡萄糖，而蛋白胨、山梨醇、甘露醇、尿素酶生化反应为（-），不能发酵分解乳糖、甘露醇。

3.4 PCR检测结果

分离菌株提取的 DNA 样品经 PCR 扩增，在 1090bp 的位置出现特异的条带，与之前各文献上报道的副猪嗜血杆菌 PCR 检测结果一致，分离菌株被鉴定为副猪嗜学杆菌。

3.5 药敏试验

根据药敏纸片标签说明，抑菌圈在 0～10mm 为低敏，10～15mm 为中敏，15mm 以上为高敏。根据该判定标准，结果抑菌圈在 15mm 以上，即为高敏的药物有，头孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林；抑菌圈在 10～15mm 为中敏的有丁胺卡那霉素、头孢氨苄、新霉素；抑菌圈在 0～10mm，即为低敏的有链霉素、多粘菌素、复方新诺明。

4 小结与讨论

副猪嗜血杆菌病是猪的重要细菌性疾病之一，属于条件性细菌病，细菌侵入于上呼吸道内，可受其他疾病继发、环境应激等多种因素的诱发，使得病情加重。近些年来，呈愈演愈烈的趋势。该菌可通过空气直接接触感染其健康猪，也可通过消化道传播。在冬春季节此病多发，猪场内环境条件差、营养不佳和管理不善等因素均可引起发病。

由于本病为机体常在菌，如果抵抗力低下，就会引起发病。对于新购入的仔猪，无论运输、饲喂及生长环境突然改变，均使应激因素增加，导致猪群抵抗力下降，将会引起发病。因此，最好是坚持“自繁自养”，是预防本病发生的重要措施之一。在引进时应确保不从疫区引进生猪，保证引进健康的猪。购回后不要急于混群，应隔离一段时间，确定健康后再混群饲养。

临床上，副猪嗜血杆菌常发生于猪其他疾病，如猪蓝耳病、猪圆环病毒Ⅱ型等疫病。平时应做好对其他疾病的免疫，以防继发感染。猪发病后要早诊断、早治疗，采取综合防治措施，使疫情尽快得到控制，减少不必要的经济损失。

在本试验中，根据发病情况、临床症状、剖检变化，以及细菌培养和 PCR 鉴定进行综合诊断，确诊为副猪嗜血杆菌病。在该病的防治上，一般在临床上都采用疫苗注射和抗菌素治疗，由于大量使用抗菌素，导致细菌耐药性的产生，使该病的预防和治疗表现更加困难。本试验对多种抗菌素药物的耐药性进行测定，结果显示流行菌株对多种药物已产生耐药性，如丁胺卡那霉素、新霉素、头孢苄胺、链霉素、多粘菌素、复方新诺明等；仅对比较少数药物较敏感，如头孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林等。在防治副猪嗜血杆菌病时，建议应以疫苗为主，可根据药敏试验进行交叉使用抗菌素，并配合中药制剂效果会更好。

[1]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京：中国农业出版社,2002.

[2]陆承平.兽医微生物学（第 4 版）[M]]北京：中国农业出版社,2007.

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[4]东北农业大学.兽医临床诊断学（第 3版）[M]北京：中国农业出版社,2001.

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10.3969/j.issn.1008-4754.2017.02.014