猪体内伪狂犬病毒分布及其神经示踪启示

（天津市动物疫病预防控制中心天津300402）

猪体内伪狂犬病毒分布及其神经示踪启示

徐国栋

（天津市动物疫病预防控制中心天津300402）

伪狂犬病(Pseudoraies,PR)是当前国内猪群中重要的疫病之一，掌握PRV在猪体内的分布规律有利于理解猪感染PRV后发生的病理过程、指导临床病理诊断和取样；理清PRV作为神经示踪物在实验动物神经系统中的循行特点将有助于理解PRV疫苗毒株和野毒株对猪的侵染机制，并启示猪神经症状出现前PRV的可能循行路线，帮助业者探究现场猪群最初感染PRV的可能途径，制定更合理的免疫程序，故笔者对国内相关研究进行综述。

1 PRV在猪体组织中的分布规律

1.1 适于PRV增殖的细胞系

PRV可在源于各胚层的细胞中复制，具有泛嗜性。在体外适于其增殖的细胞系有肾细胞（兔、猪、牛、羊、犬、猴等）、睾丸细胞（豚鼠、兔、牛等）、成纤维细胞（鸡胚、小鼠）、Vero细胞（猴）、Hela细胞（人）、EP传代细胞（兔）、BHK-21细胞（仓鼠）、小鼠骨髓间充质干细胞等。在不同的细胞系中，PRV的致病性有差异，如2013年，余文兰等研究了PRV Ra株在体外7种细胞系中的增殖规律和致病性，结果发现该毒株在不同细胞系中表现出时间依赖的致病性，随时间延长细胞，其中6种细胞（未见关于F81细胞的记载）依次出现CPE：ST细胞和PK-15细胞（18 h）、Vero细胞（28 h）、MDCK细胞（22 h）、CEF细胞和DF1细胞（130 h）；此外，在感染量一致前提下，该毒株在ST细胞中的抗原滴度最高，在PK-15细胞、Vero细胞、F81细胞中的滴度与ST细胞中差异不明显，其次在MDCK细胞中滴度较高，在CEF细胞和DF1细胞中的滴度较低。综合考虑认为ST细胞系是研究该毒株的较适宜细胞。此外，兔、鼠和鸡胚等是常用的试验动物。

1.2 PRV在猪体组织中的分布规律

PRV的传播方式包括水平传播和垂直传播，在动物体内扩散有3条途径：①扁 桃体和咽部上皮―嗅神经和舌咽神经-脊髓-大脑途径；②扁桃体和鼻咽部上皮-淋巴管-淋巴结-嗅神经、舌咽神经和三叉神经末梢-三叉神经-脑桥和脊髓-小脑和大脑途径；③病变部白细胞摄入或细胞表面吸附-病毒血症-包括孕畜胎盘和胎儿在内的全身组织途径。1992年，张斌等将3株PRV（S株、闽A株、Shope株）分别按2个不同剂量和3种不同方式（滴鼻、脑内注射、肌内注射）感染18头3周龄PRV抗体阴性仔猪，结果发现：①病猪以体温升高可达42℃、神经功能紊乱为主要临床症状。主要组织学变化是非化脓性脑脊髓炎、神经元变性和坏死、神经纤维变性，肺、扁桃体、淋巴结的炎症和坏死，部分病猪大脑皮层、胼胝体星状胶质细胞、神经节中神经元、肺、扁桃体和淋巴结中存在嗜酸性核内包涵体。②不同毒株、不同感染方式所致不同器官病理变化和严重程度有差异：3个毒株感染后均在神经节和淋巴结发现了包涵体，但3个毒株在神经不同部位中的分布仍有差异；此外，发同S株偏于消化道致病，闽A株偏于呼吸道致病，Shope株偏于扁桃体致病；3种感染方式中脑内感染病猪症状最严重，而肌内注射感染猪因未发病且缺乏相关病变。

1997年，周复春等用研制的PRV gp50基因（第434～651位共217 bp）PCR诊断试剂盒对18头自然发病仔猪组织检测发现：不同组织（器官）检出率不同，依次是：三叉神经节（100%，14/14）、嗅球（85.71%，12/14）、脑（75%，9/12）、扁桃体（54.55%，6/11）、肝（46.15%，6/13）、肺（25%，3/12）、脾（25%，3/12）、肾（7.69%，1/13）、心肌（0%，0/9）。还对2头体重35 kg的实验猪以PRV灭活苗连续5次免疫造成潜伏感染模型，攻毒15 d后剖杀感染猪并取组织（器官）进行检测，结果在三叉神经节、嗅球、脑和扁桃体组织呈阳性，在肝、脾呈阴性（心、肺、肾未检测），认为PRV在猪体内检出率依次是：三叉神经节、嗅球、脑组织、扁桃体，其次是鼻拭子（66.67%，16/24），再次是内脏器官。1998年，李学伍等用PCR法对34头自然发病猪（死胎）组织（器官）中的PRV gp50基因进行检测，检出率由高到低依次为：三叉神经节（100%，28/28）、嗅球（88.4%，23/26)、扁桃体（60.87%，14/23）、肝脏（41.38%，12/29）、脾脏（26.92%，7/26）、肺脏（25%，6/25）、肾脏（6.67%，2/30）、心肌（4.3%，1/23）。2003年，唐万勇将强毒株PRV-Ea(PRV鄂A株)颈部肌内接种血清学阴性的15日龄哺乳仔猪后，推测病毒首先在颈部淋巴结复制，其后通过局部神经未稍向中枢神经系统、通过病毒血症向全身两种途径扩散，最终致病，仔猪出现的症状和病理变化与毒株强弱、接种剂量相关。观察到的病理模型是：①仔猪感染后2～11 d内体温变化在39.5～41.5℃间；低剂量病毒感染可致仔猪阵发性颤抖，高剂量时可致共济失调、后肢瘫痪、昏厥和痒觉；②该毒株可引起多器官出血性变化，推测与血小板数量减少、微血栓形成有关；③H.E染色发现该毒株致病以非化脓性脑脊髓炎、出血性间质性肺炎、坏死性脾炎和淋巴结炎为特征；电镜下中枢神经系统神经元、肝肾细胞坏死。2005年，谷长勤等将PRV-Ea颈部肌内注射15日龄仔猪后发现：该毒株对新生仔猪致病性强，可致脑膜、肺脏、淋巴结、肾脏等多处组织（器官）出血和微血栓，尤其对肺组织嗜性较强，出血性肺炎变化显明，认为PRV-Ea与Shope株、京A株所致出血性支气肺炎变化类似，而与闽A株、S株所致轻微肺炎有差异。同年，郏自明等用H.E和SABC染色法（链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法染色）对8头15日龄PRV-Ea感染仔猪的组织进行了观察：①SABC法观察到包括大脑、小脑、脊髓和脊神经节（胸段）、淋巴结、肺、扁桃体、胸腺、脾、肝、肠、胃、肾、肾上腺等多种组织（器官）中存在阳性细胞，其中在神经组织、肺和淋巴组织内较多，组织损伤明显，尤其是出血性间质性肺炎严重，是应考虑重点的病理学指标；②病毒存在部位与该部位病理变化具有相关性，在组织增生明显的部位病毒含量较高，在出血和坏死较明显的组织病毒量含量较低甚至难以检测到；③阳性细胞的胞浆和胞核均存在病毒，但胞浆内较多。2007年，龙晓亭对4周龄PRV阴性仔猪使用灭活疫苗免疫1次、30 d后用标记毒株PRV gG-/LacZ+鼻内接种1次后建立了PRV潜伏模型，用PCR法连续5d检测鼻拭子中PRV gD基因阴性，认为该模型得以维持，再用注射地塞米松激活潜伏感染，其后用HE染色法和SABC（链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法）染色法对猪体组织中标记PRV时空分布规律进行了观察：①攻毒后7 d内猪体温变化在39.5～41.5℃间，攻毒3 d后不再自鼻腔排毒，激活后又重新排毒，推测在大脑中的潜伏形成与抗体不易通过血脑屏障有关；②两种方法观察到的组织病变部位与阳性细胞分布部位基本一致；潜伏-维持-激活期间（攻毒后7～79 d），阳性细胞广泛分布于大脑、小脑、脑干、三叉神经、视神经、扁桃体、肺和肾脏等组织（器官）；③潜伏维持期间PRV嗜神经元性强，在神经元丰富的大脑皮层阳性细胞数量较多，尽管HE染色未观察到三叉神经的明显病变，但SABC法仍检测到其中的PRV。潜伏期间PRV在非神经组织中主要分布于复层扁平上皮、肺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞等上皮细胞，其中以扁桃体内阳性细胞数最多。在细胞水平，PRV分布于感染细胞的胞质和胞核内，且胞质中较多。④激活后1～14 d，多数组织中阳性细胞数明显多于潜伏期数量（除大脑外），期间大脑内阳性细胞数量反而下降的原因可能与地塞米松能减低血脑屏障通透性或猪体内中和抗体效价较高有关。激活后在14～2l d，PRV仍可沿脊髓-脑干方向逆传。⑤多数组织内阳性细胞数量随攻毒后时间延长呈规律性减少，但神经细胞和间质性肺炎的病理损伤不易恢复或消散。2007年，刘俊磊对30日龄PRV血清学阴性仔猪2次免疫灭活疫苗，抗体达峰值时攻毒（PRV gG-/LacZ+）建立了PRV潜伏模型，用PCR法对每周采集的鼻拭子和剖杀猪组织进行检测，并在攻毒70 d后连续5 d注射地塞米松2 mg/（kg·bw）激活维持的潜伏，再分别用PCR/RT-PCR方法在DNA/RNA水平检测组织内PRV相关基因分布情况，包括β-actin（看家基因）、IE180（立即早期基因180）、EP0（早期基因）、gD（糖蛋白D）、lacZ（β-半乳糖苷酶基因）和LAT（潜伏相关转录体）。结果发现：①在攻毒后1～11 d内实验猪体温变化在39.5～41.5C°间，激活后1～14 d内其体温变化在38.5～40.5C°间；②感染7 d后即可在猪大脑、小脑、肺和三叉神经节中检测到部分相关基因，阳性结果持续到试验结束（攻毒后113 d或激活后38 d），此外，结果显示IE180基因是唯一立即早期基因，其表达持续存在；LAT在感染初期不表达或很少表达，而潜伏感染建立以后即开始大量表达；EP0基因在激活中晚期基因表达后即停止自身表达；gD作为晚期基因，其表达依赖于IE180和EP0两者的共作用；（3）PRV在组织（器官）中的分布规律是：三叉神经（100%，8/8）和脑干（100%，8/8）及扁桃体（100%，2/2）、大脑（87.5%，7/8）和嗅球（87.5%，7/8）、鼻黏膜（83.33%，5/6）、小脑（75%，6/8）和淋巴结（75%，6/8）及肺（75%，6/8）、视神经（62.5%，5/8）和脾（62.5%，5/8）、胸腺（28.57%，2/7）、肾（1.25%，1/8）、心肌（0%，0/8）和骨骼肌（0%，0/7）。

2 从PRV作为神经示踪物看其在实验动物神经组织中的分布规律

PRV可由神经突触后向突触前神经元逆行侵染神经系统，这使标记PRV作为揭示动物神经传导环路的病毒性示踪物成为可能，常用的示踪毒株有PRV-D、PRV-Bartha、PRV-BaBlu、PRV-Su等，毒株间毒力和神经嗜性略有差异，自上世纪末，此类研究多用鼠作为实验动物，未见有用猪作为实验动物的报道，但总结PRV示踪相关文献有助于理解猪PR发生的病理过程。2006年，章钧等总结了PRV示踪神经通路的进展，指出PRV膜蛋白gE、gI和Us9的缺失将致PRV-Bartha株毒力降低，但其跨神经元传播和在神经纤维中进行复制的能力未见明显下降，可沿神经环路逐一侵染且不自神经元胞体逸出感染邻近细胞，示踪特异性强，因此，可以作为神经解剖学中神经传导通路及其功能研究的示踪物。2014年，李碧等综述了PRV神经传导机制：PRV囊膜中糖蛋白gB、gD、gL和gH与神经传导有关，gC、gE、gI、gG与传导方向有关，因神经细胞内微管驱动蛋白3可与US9基因表达产物相结合后介导PRV的顺行传导，且US9.gE和gI基因的产物gE/gI影响了PRV顺行传导至轴突末端后的出胞运动，因此gE和gI基因均为PRV顺行传导必需基因，减毒PRV疫苗株因缺失了US9.gE和gI基因而使失去顺行传导能力，仅具有逆向传导能力，野毒株因具有US9. gE和gI基因而具有双向传导（顺行传导／逆向传导）能力。2006年，张敬东等在脑瘫模型的SD大鼠坐骨神经接种PRV（Su株）后，用免疫组化法观察到接种鼠左侧脊髓前角存在感染细胞，并于4天左右达到高峰，而同侧脊髓后角、对侧脊髓和颈段脊髓未见有感染细胞，即PRV沿坐骨神经中的运动神经纤维逆行传导至脊髓前角，腰段脊髓神经元和颈段脊髓神经元并无直接神经元突触相连。2008年，张凤用两株标记PRV（PRV-gG—Lacz+、PRV-gG—TK—EGFP）作为神经束路示踪物，研究了SD雌性大鼠关元穴针刺信号向中枢神经传导的通路，分别在关元穴注射两株PRV后对大鼠进行连续3 d电针刺激，其后取其脑和脊髓，用免疫组化法对冰冻切片组织中的阳性细胞核团进行定位和阳性细胞计数，用单因素方差对不同分组检查结果进行分析后发现：感染大鼠脊髓、脑干、下丘脑、前脑和皮层中的神经核均发现了阳性细胞。不同毒株组均发现脊髓腹角中感染细胞较背角细胞大；不同毒株组在脑干中阳性细胞核团的分布略有差异，推测与毒株特性相关；不同毒株组的“去卵巢”大鼠下丘脑核团阳性细胞数均明显减少，而“去卵巢+电针刺激”大鼠下丘脑核团阳性细胞数明显升高，推测与内分泌密切相关。可以推知，不同PRV毒株对大鼠中枢神经细胞核团的侵染部位略有差异，且侵染程度与机体内分泌功能密切相关。2009年，巩腾用PRV（Bartha株）作为不跨膜逆轴浆神经突触示踪物，研究了SD大鼠颈髓固有束相关周围运动神经通路（调控上肢随意运动）体系的分布，将PRV穿刺侵染大鼠颈8或胸1神经前根附近神经束，并在术后4 h免疫组化染色法检查相关组织，结果发现PRV在相关神经组织中呈规律分布：颈部不同髓节的二级、多级运动性固有神经元中PRV分布数量依次为3～4髓节、1～2髓节、5～6髓节，而7髓节中数量极少；颈部不同髓节的运动性固有束神经纤维中PRV分布数量依次为3～4髓节、5～6髓节、颈8或胸1髓节、颈1～2髓节。2012年，叶达伟将PRV-614接种到C57BL/6J小鼠的左侧肾脏上极，用荧光免疫组织化法观察阳性神经元的动态分布，结果发现自第3天起至第6天，PRV存在于调节肾脏交感神经活性的各级神经元，依次向中枢逆传至脊髓段、延髓头端腹外侧核和中缝核、脑桥中A5区域和蓝斑核及亚蓝斑核、脚桥被盖核致密部和尾端被盖背外侧核；随接种时间延长，阳性神经元逐渐增多。最终认为PRV接种后在相关神经组织中的逆行传递具有时空特异性。

3 小结

1）猪PR的重要临床指征有：①体温升高。首次感染后体温区间在39.5～41.5℃间，再次感染体温区间在38.5～40.5℃间；②神经系统征候。如哺乳仔猪八字腿、肌震颤、流涎、癫痫样发作甚至搔痒等；③呼吸道征候。如干咳、喘；④消化道症状。如腹泻，有研究认为近年来流行的哺乳仔猪腹泻可能与PRV感染相关。

2）在细胞水平，PRV相关基因可发现于胞核和胞质中；PRV在猪体内分布及其含量的决定因素包括：毒株毒力、入侵途径、免疫状态，不同PRV株可引起不同组织（器官）不同程度的病理过程，强毒株常分布于包括中枢神经系统在内的全身各种组织，如PRV-Ea株、Shope株和京A可引起典型出血性肺炎，而弱毒株或中强毒株的增殖限于神经系统，不引起中枢神经系统外的组织出现病变，临床中最易检测到PRV的器官有三叉神经、嗅球、脑、脊髓、扁桃体和肺脏等，这些部位也常是该病毒的潜伏场所。

3）PRV侵染神经系统将沿固定的神经环路传导，病毒在神经系统中的分布和循行路线呈现规律性，且具有时空特异性，入侵神经后数天可能存在感染高峰，或随时间延长感染的神经元增多，出现的神经症状与相应神经环路病理过程有关，不同感染部位、不同神经通路将决定病猪出现不同神经症状。

4）地塞米松激活PRV潜伏的事实提示：PRV高感染率猪群中存在的任何免疫抑制因素均可能激活潜伏的PRV，最终导致群体性发病，因此，消除潜在免疫抑制因素、慎用免疫抑制性药物可提高猪群存活率。

5）PRV在SD大鼠神经系统中的分布和含量与生殖相关内分泌激素相关的事实提示：猪群免疫程序的制定应充分考虑猪群的现实生产状态，如孕后期猪群应用弱毒疫苗免疫是否合理？

6）PRV潜伏的部位包括神经系统、扁桃体和肺脏等，其潜伏-维持-激活的特点有着内在的分子机制，这种致病特点决定了野毒株不易自感染猪群中清除，根除和净化是最好的猪PR防治策略，但代价高，若退而求其次，则合理运用弱毒疫苗和灭活疫苗的免疫学原理，免疫与逐步淘汰感染种猪相结合，不失为有效的防治策略。■

略

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.1.002