软骨移植技术的发展及现状

姚旺林，张加廷，张仲文

• 综述| REVIEW ARTICLES •

软骨移植技术的发展及现状

姚旺林，张加廷，张仲文

关节软骨缺损是一种常见的关节病变，由于关节软骨缺乏自我修复能力，一旦损伤难以完成再生修复。针对软骨不能自我修复的特点，临床做出了一系列的探索，目前针对软骨损伤的治疗主要有药物保守治疗、关节镜下探查清理术、马赛克技术、微骨折技术、骨膜移植术、软骨移植技术等。其中，软骨移植技术已成为修复软骨缺损的有效手段，该技术属于细胞型骨组织工程，主要包含三要素：种子细胞、支架和生物调控因子。笔者通过查阅相关文献，对软骨移植技术中三要素的发展及现状进行综述。

软骨移植技术；种子细胞；支架；生物调控因子

软骨是由高度分化的软骨细胞和胶原基质组成的一种不含血管、神经的结缔组织，其营养来源主要是通过关节运动产生压力，将含营养成份的关节液压入软骨组织中[1]。软骨缺乏自我修复能力，损伤后无法完成正常修复[2]。软骨损伤后因疼痛限制关节正常运动形式，而关节正常运动形式的改变又进一步加剧软骨的破坏[3]，最终导致骨性关节炎（osteoarthritis，OA）。针对软骨不能自我修复的特点，医学界做出了许多探索，目前软骨损伤治疗主要有药物保守治疗、关节镜下探查清理术、马赛克技术、微骨折技术、骨膜移植术、软骨移植技术等[4]，笔者主要对软骨移植技术的发展、现状进行阐述。

骨组织工程是应用工程学和生命科学的基本原理研制出一种能够替代损伤组织的替代物[5]。根据目前的研究现状分为非细胞型和细胞型组织工程两类。软骨移植技术属于细胞型骨组织工程，主要包含三要素：种子细胞，在移植到的活体内起增殖、分化、修复作用；支架分生物型和非生物型，作用是给种子细胞提供三维的生长空间，并携带细胞生长所必须的因子和营养，支架一般可被人体吸收或逐渐降解[6]；生物调控因子，作用是维持种子细胞的生长或在体外引导细胞向某一方向分化。

1 种子细胞

软骨移植技术中所用种子细胞大致分两类，一类是软骨细胞，另一类是能在外界因素（如细胞因子）的诱导下向软骨细胞分化的，具有形成软骨基质能力的非软骨细胞，这样才能达到软骨缺损区透明软骨的修复目的[7]。

1.1 软骨细胞 软骨细胞来源明确、分化程度高、取材方便，因此被视为软骨移植技术中最为重要的种子细胞，也是目前临床常用的种子细胞[8]。软骨细胞又分为自体软骨来源的软骨细胞和异体软骨细胞。

1.1.1 自体软骨细胞 自体软骨细胞一般是取自患者自身关节非负重区的单纯软骨组织，不包含软骨下骨等其他成份，在体外通过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化分离出单一的软骨细胞[9]，不同实验者的提取方式、流程各不相同。Saltzman与Mumme等[10,11]研究证明，自体软骨细胞移植技术修复软骨缺损疗效满意；动物模型研究发现，软骨缺损区新产生的为透明软骨，快速冰冻切片显示新生软骨和正常软骨连接牢固。自体软骨细胞移植因其高度分化的软骨细胞和透明软骨式修复的独特优势，目前已成为软骨缺损修复中的研究热点。但自体软骨组织来源存在一定的限制，因自体软骨组织取自患者自身，该处软骨同样具有自我不可修复性，并会增加患者的不适和疼痛感。另外，有研究表明，软骨细胞在体外增殖传代培养时存在去分化现象，软骨细胞体外培养至第三代活性良好，从第四代以后活性开始降低，至第五代时部分细胞出现去分化现象[12]，从而丧失分化成软骨的能力，使其临床应用受到限制。因此，如何从少量软骨组织中获取大量软骨细胞；如何改善细胞提取流程，避免细胞在提取过程中死亡；是否可从缺损区提取出具有活性正常软骨细胞等一系列问题仍需进一步研究。

1.1.2 同种异体软骨细胞 同种异体软骨的研究及应用在我国尚不多见，但国外已有相关成功的报道[13]。同种异体软骨移植面临着免疫排斥和相关伦理问题。针对免疫排斥，目前研究界存在不同的声音。有研究发现，Ⅱ型胶原抗体可能会引起关节炎[14]；但Lohan等[15]研究认为，异体软骨细胞具有减少主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ）表达和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）分泌的作用，从而调节巨噬细胞活性，进而逃避宿主的免疫排斥。那么异体细胞分泌的Ⅱ型胶原是否会引起受体免疫排斥反应，甚至发生关节炎也是目前应该考虑的一个问题。另外，异体软骨细胞移植也存在着一定的伦理学问题及疾病传播风险。但同种异体软骨移植技术组织来源广泛，能够获得大量的软骨组织，保证软骨细胞的数量，并且不会对患者造成二次损伤，不失为一种新的研究方向。

1.2 非软骨细胞 软骨移植技术中的非软骨种子细胞主要指那些在相关因子或（和）软骨细胞共培养情况下能向软骨细胞分化或具有成软骨能力的细胞[16]，如骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）、脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）、滑膜间充质干细胞（synoviumderived mesenchymal stem cells，SMSCs）等[17]。BMSCs主要来源于骨髓，外周血中也存在少量，其来源广泛、取材方便、分离简单，具有多向分化的能力，在转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等作用下可向软骨细胞分化[18]。因此，BMSCs可作为种子细胞弥补自体软骨细胞的不足[19]，但目前的研究仅局限于实验室，尚未见临床治疗应用的报道。ADSCs来源更为广泛、取材方便，同样也可向软骨细胞分化，但是其成软骨能力相对于BMSCs较弱。Choi等[20]研究发现骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和BMP-4能诱导ESC向软骨细胞分化。UCMSCs与软骨细胞共培养也具有向软骨细胞分化的潜能；SMSCs来源于关节囊内的滑膜，增殖能力较软骨细胞强，不易出现去分化现象。但目前学术界对于SMSCs存在一定争议，有研究指出SMSCs培养时能够快速形成单细胞，局部移植可修复损伤组织，能够应用于组织工程技术[21]。另有研究发现，SMSCs和软骨细胞共培养的情况下能够抑制软骨细胞的活性，且随着培养代次的增加，抑制能力也越大，是OA发生的机制之一[22]。

软骨移植术中的种子细胞，应有良好的增殖、维持表型及成软骨等能力，并能够和支架融合附着于软骨缺损区。目前自体软骨细胞存在取材受限等问题，同种异体软骨细胞和非软骨细胞均多处于实验室研究阶段，鲜有应用于临床的报道。因此如何获取大量、单一的软骨细胞是临床亟待解决的问题，也是软骨移植技术的重点。

2 支 架

从广义上讲，能让软骨细胞停留在软骨缺损区的物质均可称为支架，它是为细胞提供存留和增殖的临时基质，可为以后的组织修复提供条件。自1987年瑞典哥德堡大学首次施行人类自体软骨细胞移植术以来，软骨移植技术从第一代发展到第四代，目前解放军总医院提出了第五代，其支架也逐渐由简单到复杂。目前常用的载体材料分为生物材料和人工合成材料。生物材料主要包括胶原蛋白、壳聚糖、藻酸盐等，这类材料具有组织相容性好的特点，有利于种子细胞附着和增殖，容易成软骨。人工合成材料有聚乳酸、聚羟基醋酸等，能够在组成成份、形态结构、机械性能及降解速度等方面做出一定的调控，较生物支架有着一定的优势[23]，但是其最大缺点在于缺乏细胞识别信号，不利于种子细胞的特异性黏附。

第一代自体软骨细胞移植采用骨膜覆盖缝合的方法，把细胞留存于缺损区，其缺点是需要取自体骨膜、操作复杂、切口大，对自体损伤较大，同时软骨细胞容易流失，造成仅是单纯的骨膜修复，并容易出现移植物过度增生现象，疗效较差[24]；第二代支架为单层Ⅰ/Ⅲ胶原膜，和第一代相比疗效并无明显差异，且仍存在移植物过度增生及细胞分布不均、容易流失等缺点[25]。1999年组织工程学领域出现双层Ⅰ/Ⅲ型胶原膜后，即第三代支架，由先前的二维支架发展为三维支架，这种三维支架模型更适于细胞的分布和生长，不易流失，克服了前两代的缺点，并且其切口小、不需骨膜缝合或额外固定。随后，从双层Ⅰ/Ⅲ型胶原膜，又发展到Ⅰ/Ⅱ型胶原膜。不论是Ⅰ/Ⅲ型胶原膜或Ⅰ/Ⅱ型胶原膜均有利于软骨细胞的附着和生长，能够维持细胞的表型稳定。第四代支架基于凝胶基质，其原理是将细胞和凝胶制成混合物，然后将其涂抹于关节缺损区，该方法相比前三代具有操作简单、制备简单、凝固快，不需额外用生物胶固定等优点[26]，基于纳米技术和3D打印技术[27]，解放军总医院提出了第五代支架——3D支架，模拟人体骨组织，兼顾软骨下骨和软骨组织，有望解决软骨缺损修复中骨部分和软骨部分的连接问题[28]。构建合适的三维支架是种子细胞能够成功黏附、增殖及维持表型的关键，也是该领域研究的热点。

3 生物调控因子

软骨细胞可通过自分泌和旁分泌基质产生细胞因子，从而相互影响维持表型的稳定；而非软骨细胞在细胞因子的影响下可向软骨细胞分化，这类因子主要有BMP、成纤维细胞生长因子（filbroblast growth factor，FGF）、TGF-β、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）等[29]。其中，应用于软骨移植技术方面的主要是FGF、TGF-β、IGF，均可促进种子细胞的快速增殖和软骨组织的形成[30]，其中TGF-β能够促进间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的增殖和分化，同时促进成软骨细胞增殖和细胞基质的合成，合适溶度的IGF能够促进细胞合成胶原并防止胶原纤维破裂。在软骨细胞移植技术中，选择合适的细胞生长因子，在促进种子细胞的增殖和细胞外基质的合成及加速软骨的修复方面能够发挥一定作用。

4 展 望

目前，软骨移植技术中的自体软骨细胞移植技术是软骨缺损修复的前沿技术，涉及到生物组织工程中的多个领域。随着种子细胞提取工艺的成熟、非软骨细胞在细胞因子作用下诱导分化为软骨细胞技术的进一步成熟及支架材料不断向人体骨组织结构方向的发展和更新，软骨缺损的临床治疗将会出现重要变化。

[1]周建林，方洪松，彭 昊，等.自体、异体骨软骨移植及组织工程材料修复的关节软骨损伤[J].中国组织工程研究，2015，19（34）: 5530-5535. DOI: 10.3969/ j.issn.2095-4344.2015.34.023.

[2]Verdonk P, Dhollander A, Almqvist K F, et al. Treatment of osteochondral lesions in the knee using a cell-free scaffold [J]. Bone Joint J, 2015, 97-B（3）: 318-323. DOI: 10.1302/0301-620X.97B3.34555.

[3]Abdel-sayed P, Pioletti D P. Strategies for improving the repair of focal cartilage defects [J]. Nanomedicine(Lond), 2015, 10（18）: 2893-2905. DOI: 10.2217/nnm.15.119.

[4]Bhattacharjee M, Coburn J, Centola M, et al. Tissue engineering strategies to study cartilage development, degeneration and regeneration [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 84:107-122. DOI: 10.1016/j.addr.2014.08.010.

[5]姜骆永, 陈洁琳, 崔家鸣, 等.自体软骨细胞移植技术修复关节软骨损伤研究进展[J]. 中国运动医学杂志, 2016, 35（8）: 784-788. DOI: 10.16038/j.1000-6710. 2016.08.015.

[6]陆宵彤, 邢珍珍, 郑济林, 等. 组织工程三要素结合领域在软骨修复的研究进展[J]. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29（5）: 632-635. DOI: 10.7505/1003-1892.20150135.

[7]张洋洋, 彭效祥, 赵荣兰. 组织工程化软骨修复关节软骨损伤研究进展[J]. 国际骨科学杂志, 2017, 38（1）: 42-45. DOI: 10.3969/j.issn.1673-7083.2017.01.010.

[8]Zhang C, Cai Y Z, Lin X J. Autologous chondrocyte implantation: Is it likely to become a saviour of large-sized and full-thickness cartilage defect in young adult knee? [J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 2016, 24（5）: 1643-1650. DOI: 10.1007/s00167-015-3643-3.

[9]Melgarejo-Ramírez Y, Sánchez-Sánchez R, García-López J, et al. Characterization of pediatric microtia cartilage: a reservoir of chondrocytes for auricular reconstruction using tissue engineering strategies [J]. Cell Tissue Bank, 2016, 17（3）: 481-489. DOI: 10.1007/s10561-016-9574-5.

[10]Saltzman B M, Lin J, Lee S. Particulated juvenile articular cartilage allograft transplantation for osteochondral talar lesions [J]. Cartilage, 2017, 8（1）: 61-72. DOI:10.1177/1947603516671358.

[11]Mumme M, Barbero A, Miot S, et al. Nasal chondrocytebased engineered autologous cartilage tissue for repair of articular cartilage defects: an observational first-in-human trial [J]. Lancet, 2016, 388（10055）: 1985-1994. DOI: 10.1016/S0140-6736(16)31658-0.

[12]赵海洋, 马子君, 路 屹, 等. 兔关节软骨细胞原代培养及生物学鉴定[J]. 中国老年学杂志, 2015, 35（4）: 1049-1051. DOI: 10.3969/j.issn.1005-9202.2015.04.084.

[13]Levy Y D, Görtz S, Pulido P A, et al. Do fresh osteochondral allografts successfully treat femoral condyle lesions? [J]. Clin Orthop Relat Res, 2013, 471（1）: 231-237. DOI: 10.1007/ s11999-012-2556-4.

[14]乔占清, 张 俊, 马 赛, 等. 同种异体软骨细胞-聚羟基乙酸支架复合物修复甲状软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2016（12）: 1711-1717. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.006.

[15]Lohan P, Treacy O, Lynch K, et al. Culture expanded primary chondrocytes have potent immunomodulatory properties and do not induce an allogeneic immune response [J]. Osteoarthritis Cartilage, 2016, 24（3）: 521-533. DOI: 10.1016/ j.joca.2015.10.005.

[16]杨 萌, 邵 博, 龚忠诚, 等. 三维环境下软骨细胞诱导滑膜间充质干细胞向软骨样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2016（11）: 1544-1550. DOI: 10.3969/ j.issn.2095-4344.2016.11.004.

[17]Anastasiu D M, Cean A, Bojin M F, et al. Explants-isolated human placenta and umbilical cord cells share characteristics of both epithelial and mesenchymal stem cells [J]. Rom J Morphol Embryol, 2016, 57（2）: 383-390.

[18]Carbone A, Valente M, Annacontini L, et al. Adipose-derived mesenchymal stromal (stem) cells differentiate to osteoblast and chondroblast lineages upon incubation with conditioned media from dental pulp stem cell-derived osteoblasts and auricle cartilage chondrocytes [J]. J Biol Regul Homeost Agents, 2016, 30（1）: 111-122.

[19]Chung R, Foster B K, Xian C J. Preclinical studies on mesenchymal stem cell-based therapy for growth plate cartilage injury repair [J]. Stem Cells Int, 2011（1）: 570125. DOI: 10.4061/2011/570125.

[20]Choi H, Jeong B C, Hur S W, et al. The angiopoietin-1 variant COMP-Ang1 enhances BMP2-Induced bone regeneration with recruiting pericytes in critical sized calvarial defects [J]. Plos One, 2015, 10（10）: e0140502. DOI: 10.1371/journal. pone.0140502. eCollection 2015.

[21]Choi W H, Kim H R, Lee S J, et al. Fetal cartilage-derived cells have stem cell properties and are a highly potent cell source for cartilage regeneration [J]. Cell Transplant，2015, 25（3）: 449-461. DOI: 10.3727/096368915X688641.

[22]Lee C M, Kisiday J D, Mcilwraith C W, et al. Synoviocytes protect cartilage from the effects of injury in vitro [J]. BMC Musculoskelet Disord, 2013, 14（1）: 54. DOI: 10.1186/1471-2474-14-54.

[23]王之发. 细胞外基质支架材料在软骨组织再生和骨组织工程中应用的初步探讨[D]. 西安: 第四军医大学, 2016.

[24]方洪松, 周建林, 彭 昊, 等. 组织工程支架材料修复关节软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20（52）: 7891-7898. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.020.

[25]Hunziker E B, Lippuner K, Keel M J, et al. An educational review of cartilage repair: precepts & practice-myths & misconceptions-progress & prospects [J]. Osteoarthritis Cartilage, 2015, 23（3）: 334-350. DOI: 10.1016/ j.joca.2014.12.011.

[26]van Duijvenbode D C, Jonkers F J, Könst Y E, et al. Geltype autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in patients with prior ACL reconstruction: A retrospective two year follow-up [J]. Knee, 2016, 23（2）: 241-245. DOI: 10.1016/j.knee.2015.08.015.

[27]徐奕昊. 3D打印技术辅助精细化构建组织工程鼻翼软骨的研究[D]. 北京: 北京协和医学院, 2014.

[28]潘育松, 丁国新, 王 静. 关节软骨损伤和缺损修复策略[J]. 中国骨伤, 2013, 26（2）: 175-178. DOI: 10.3969/ j.issn.1003-0034.2013.02.024.

[29]Scotti C, Gobbi A, Karnatzikos G, et al. Cartilage repair in the inflamed joint: considerations for biological augmentation towards tissue regeneration [J]. Tissue Eng Part B Rev, 2016, 22（2）: 149-159. DOI: 10.1089/ten. TEB.2015.0297.

[30]Wang W, Li J, Wang K, et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-B and elongated cell shape [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2016, 310（5）: C357-C372. DOI: 10.1152/ajpcell.00300.2015.

（2017-02-28收稿 2017-06-20修回）

（本文编辑 付 辉）

Development and present status of cartilage transplantation

YAO Wanglin, ZHANG Jiating, and ZHANG Zhongwen. The Forth Department of Orthopedics, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China

ZHANG Zhongwen, E-mail: zhang6816151@163.com

Articular cartilage defects is a common joint disease. Since the articular cartilage lack the self-repair capacity, it cannot regenerate or recover once damaged. In accordance with these characteristics, the clinic has conducted a series of explorations. At present, the main treatments for cartilage injuries include conservative medication therapy, exploratory debridement under arthroscope, mosaic technology, microfracture technique, periosteum transplantation and cartilage transplantation, etc. Cartilage transplantation has become an effective means to repair cartilage defects. This therapy is catagorized as cellular bone tissue engineering, and contains three factors: seed cell, scaffold and biological control factors. The author reviewed the development and present status of these three factors in cartilage transplantation by consulting the relevant literature.

cartilage transplantation; seed cell; scaffold; biological control factor

R318

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.07.015

首都临床特色应用研究项目（Z161100000516013）

100039 北京，武警总医院骨四科

张仲文，E-mail: zhang6816151@163.com