豆豉纤溶酶等微生物源纤溶酶的研究与应用进展

沈畅萱，王修俊*，黄珊

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药省级重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025）

豆豉纤溶酶等微生物源纤溶酶的研究与应用进展

沈畅萱，王修俊*，黄珊

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药省级重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025）

豆豉纤溶酶是从我国传统发酵食品豆豉中分离得到一种具有溶解血纤维蛋白作用的蛋白酶。该文对近五年以豆豉纤溶酶为代表的微生物源纤溶酶的产生菌株筛选诱变与基因克隆表达、发酵工艺优化、酶的分离纯化、纤溶酶功能研究与相关制剂及保健品的开发方面的研究进行综述，对当下国内外对纤溶酶的研究现状进行分析探究，对其应用前景与发展方向进行展望，并对纤溶酶的研究方向提出建议。

纤溶酶；菌种筛选；发酵工艺；纯化

血纤维蛋白在凝血酶的作用下形成血液凝块，与此同时，血纤维蛋白也会被纤溶酶分解[1]。正常情况下，血纤维蛋白的形成与分解是平衡的，但在血纤维蛋白不能被水解的非平衡状态下，血液凝块会在血管中沉积成血栓，造成心血管疾病和心肌梗塞[2]。据世界卫生组织报道，每年有1 700万人因此丧生。纤溶酶由组织型纤溶酶原激活剂催化，从纤溶酶原转化而来，作用是及时水解并清除血栓。

目前用于血栓临床治疗的典型溶栓剂为链激酶和尿激酶。链激酶是从一种溶血性链球菌培养液中得到的非酶蛋白质，能使激活生成纤溶酶原激活剂；尿激酶是肾小管上皮细胞所产生的蛋白分解酶，属于纤溶酶原激活剂。但这两种药物均具有半衰期短、成本高、需要高剂量注射以及过敏和出血等副作用[3]。而纤溶酶是人体固有成分，能直接降解血纤维蛋白、分解血栓，具有安全性与高效性。目前已在昆虫[4]、蛇毒[5]、褐藻[6]以及主要由杆菌发酵的食品（如豆豉[7]）中发现纤溶酶。其中通过微生物生产纤溶酶的速度快、周期短，能加快生产进程和主要过程变量的影响。因此，通过各种微生物得到的纤溶酶引起了广泛的医学兴趣，且有大量研究对纤溶酶以及通过日常摄入含有纤溶酶的发酵食物来防止血栓的产生进行了研究[8]。

1987年，SUM IH等[9]从日本的传统大豆发酵食品纳豆中发现了具有高纤溶酶活力的纳豆激酶，发现其溶解血栓的速度是尿激酶的19倍之多；韩国学者KIMW等[10]从本国的传统发酵食品Chung kook-Jang中也分离得到了一种由芽孢杆菌属（Bacillus sp.）CK11-4分泌的具有高活性的纤溶酶CK11-4。随之，我国的研究人员相继从豆豉、酱油等传统大豆发酵食品中筛选出具有高纤溶活性的纤溶酶，故被定名为豆豉纤溶酶[11-12]。随着对纤溶酶的研究，被发现的产生纤溶酶的微生物来源也越来越多，对这些微生物以及相关纤溶酶的研究也层出不穷，本文对近五年国内外关于产纤溶酶菌株的筛选、诱变与基因克隆，纤溶酶发酵工艺优化，纤溶酶的分离纯化，纤溶酶酶学特性与生物学特性，豆豉纤溶酶功能的研究及其制剂和保健品的开发方面的研究进行综述，以期全面且客观了解国内外关于纤溶酶的研究现状，并对纤溶酶的应用前景与发展方向进行展望，并结合国外研究重点对国内研究方向提出建议。

1 产纤溶酶菌株的筛选、诱变与基因克隆研究

对产纤溶酶菌株进行筛选与诱变，能为开发新型溶栓剂提供备选菌种与理论基础。朱春节等[13]从豆豉样品中获得一株形态与现存产纤溶酶微生物差异较大的菌株HS9，进行分类鉴定，属于绿脓杆菌（Pseudomonas aeruqinosa），是未见报道的产豆豉纤溶酶菌株，推测该酶为天冬氨酸蛋白酶，是一种新型的豆豉纤溶酶。马晶等[14]以酱醅、豆豉为原料筛选出酶活达1 969U/m L的枯草芽孢杆菌纳豆亚种。龚福明等[15]在云南红河传统发酵豆豉中分离得到产豆豉纤溶酶枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）LC-2-1，其豆豉纤溶酶的基因分析结果与纳豆激酶和其他豆豉纤溶酶差异显著，酶活79.84U/m L。CHENGG等[16]以冬虫夏草的寄生菌体为发酵菌种，获得的纤溶酶酶活达到1 467.4 U/mg。TANEJA K等[17]垃圾堆土壤中筛选出沙雷氏菌属（Serratia sp.）KG-2-1菌种，发酵得到的纤溶酶溶栓能力要高于血纤维蛋白酶。

菌株诱变的方法有紫外线、亚硝基呱、钴（60Co）、硫酸二乙酯及其复合等物理化学方法。袁军等[18]诱变得到的菌株产豆豉纤溶酶酶活达18 228U/m L，比诱变出发菌株的酶活力提高了107%。卞承荫等[19]诱变得到的菌株所产酶酶活力保持在16 351U/m L左右。

基因工程改造技术与菌种的筛选诱变均为提高纤溶酶产量的方法。齐海萍等[20]应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增出豆豉纤溶酶基因，将该基因克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒EC-BS8上，构建成表达质粒EC-BS8，再将其转化到枯草芽孢杆菌Bs6中，筛选表达菌株，获得重组菌纤溶酶活力高达9 830 IU/m L，是出发菌株活力的2.9倍。

2 纤溶酶发酵工艺优化研究

对发酵条件的优化也是提升纤溶酶产量的方法之一。SOUZA FA SDD等[21]通过中心复合设计优化了解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）UFPEDA 485的发酵条件，以2%的大豆粉和1%的葡萄糖为底物，以200 r/min的转速发酵48h，pH值为7.2，最适温度37℃。VIJAYARAGHAVAN P等[22]以芽孢杆菌属（Bacillus sp.）IND12为研究对象，选取成本低廉的牛粪便为固体发酵底物，通过星点旋转设计与响应面法优化其发酵工艺，最终酶产量达到4 143U/g，实现了4.2倍的增长。张旭等[23]优化到培养基最佳组成为蛋白胨11.4 g/L，硫酸镁0.5 g/L，NaCl1 g/L，豆豉纤溶酶的最大产量为21.33 FU/m L，比优化前提高了79.55%。王昶[24]对诱变后的菌种培养条件进行优化，得到最合适碳源为2%麦芽糖，氮源为3%的蛋白胨、酵母膏和牛肉浸膏，K2HPO4/KH2PO4为0.2%/0.1%，MgSO4量为0.1%；培养时间为72 h，培养温度为37℃，初始pH为7，接种量为0.5%，酶产量达到53FU/m L。杨林等[25]对菌株JXNUWX-1产纤溶酶条件进行优化，得出发酵条件为玉米淀粉添加量2.91%，牛肉粉添加量1.76%，最适pH值为7.47，此时酶活是优化前8.9倍。

3 纤溶酶的分离纯化

纤溶酶分离纯化关键在于要尽可能保证酶活、得率和纯度。通常根据具体实际情况，将过滤、离心、盐析、超滤、凝胶过滤和层析分离等提取方法进行不同组合。整个分离纯化过程应在较低温度下进行，同时应注意防止杂菌污染，以免微生物降解蛋白酶，从而使酶活力稳定性受影响[26]。AVHAD D N等[27]利用Sephadex G 100凝胶层析介质，对球形芽孢杆菌（Bacillussphaericus）MTCC 3672的发酵产物进行纯化，提取率达到39%，提高了38倍。CHANGC T等[28]采用硫酸铵分级连续步骤、聚丙烯酰胺葡聚糖S-200HR凝胶为过滤层析介质和PBE 94色谱聚焦对发酵红豆豆豉进行纯化得到豆豉纤溶酶，纤溶酶的纯化量实现了291倍的增长。CHENGG等[16]以冬虫夏草的寄生菌体为发酵菌种，通过疏水作用、离子交换和凝胶过滤层析，从发酵上清液中提取纤溶酶，实现了36倍的增长，产量为5.8%。温健等[29]采用乙醇沉淀法对枯草芽孢杆菌纤溶酶进行纯化，最后将得到的粗提液进行冷冻干燥，酶活回收率为89.7%，纯化倍数为1.72，冻干粉得率为7.611g/L，单位酶活为137190.57 IU/g。王鹏娇等[30]将HPD-400型大孔树脂用于豆豉溶栓酶的分离纯化，豆豉溶栓酶比活性2 254.29 IU/mg，纯化数44.17倍。胡国军等[31]采用低温（4℃）、加入4%的活性炭粉末脱色、分段盐析以及葡聚糖凝胶G-50层析分离的方法纯化纤溶酶，最终得到的豆豉纤溶酶酶液纯化倍数为27.74倍，活性回收率69.7%，比活力13 946.1 IU/mg。

4 纤溶酶酶学特性与生物学特性研究

对豆豉纤溶酶特性的研究，能辅助控制发酵时最有条件，提高发酵效率。CHANG C T等[28]对从红豆豆豉中分离纯化得到的豆豉纤溶酶进行生化性质分析，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定得到其分子质量为29.93 kDa，通过等电点聚焦电泳得到其等电点为6.35，其最适培养基为N-琥珀酸-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基酰苯胺（p-nitropropionanilide，p-NA），在此为底物发酵时，其米氏常数为0.59mmol/L，最大反应速度为79.4μmol p-NA/（m in·mg），最适作用pH值为9，最适反应温度为60℃，苯甲基磺酰氟、N-溴代琥珀酰亚胺和伍德沃德氏试剂K几乎完全抑制分离纯化得到的纤溶酶的活性，结果证明所得到的豆豉纤溶酶为枯草芽孢杆菌蛋白酶。SUN Z等[32]研究得出纤溶酶A feE的最适温度为40℃，pH范围在7.0～12.0，被苯甲基磺酰氟、大豆胰蛋白酶抑制物、N-甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮和甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮强烈抑制，被Cu2+、Co2+和Zn2+部分抑制；与纤维蛋白原相比，纤溶酶AfeE对纤维蛋白有更强的底物特异性。CHOIJH等[33]对纤溶酶C142进行研究，得到其分子质量为23.5 kDa，最先21个氨基酸的N-末端氨基酸序列为AQSVPYGISQIKAPALHSQGY，最适pH值、最适温度、pH稳定范围和热稳定性分别为6、40℃、pH 6～8和20～35℃，对苯甲基磺酰氟和乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸敏感，证明C142为丝氨酸金属蛋白酶，C142对组织血纤维蛋白溶酶原活化剂有很强的特异性，其在H-D-甘氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-对硝基酰苯胺底物上培养所测得的米氏常数、最大发酵速度和转化数分别为0.34mmol/L、0.25mmol/（min·mg）和46.83s-1。SOUZA FASDD等[21]对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）UFPEDA 485发酵得到的纤溶酶进行研究，该酶被苯甲基磺酰氟和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）所抑制，为金属线丝氨酸蛋白酶，其最适pH值为7.0，最适温度为37℃，12h内稳定，适合作为溶栓剂进行开发利用。张雪等[34]测得豆豉纤溶酶S-7FE-1具有激酶活性，且高于直接纤溶活性；具有良好的冻融稳定性和热稳定性，最适温度30℃，高于30℃后酶活逐渐降低；最适pH值8，在pH 4～9之间保持稳定；低剂量的金属离子K+、Li+、Ba2+、Mn2+、Zn2+对豆豉纤溶酶S-7FE-1有激活作用，Na+、Mg2+、Cu2+、Ca2+、Fe2+对其活性有微弱的抑制作用，而Fe3+完全抑制其活性；10mmol/LEDTA对其有明显的抑制作用，而苯甲基磺酰氟使其完全丧失活性，因此推断豆豉纤溶酶S-7FE-1是一种含金属离子的丝氨酸蛋白酶。龚福明等[15]对得到的菌株HS9所产豆豉纤溶酶进行研究，得到该酶分子质量约为34 kDa，最高酶活pH 8.0～8.5，最适作用温度48℃，作用方式为直接水解纤维蛋白，胃蛋白酶抑制剂在工作浓度1μmol/L时能完全抑制其活性，推测该酶为天冬氨酸蛋白酶，是一种新型的豆豉纤溶酶。CHENGG等[16]对以冬虫夏草的寄生菌体为发酵菌体得到的溶纤酶进行研究，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的分子质量为28 kDa，等电点pH（9.0±0.2），是碳水化合物含量为1.67%的糖蛋白，酶的最适温度37℃，最适pH 7.2，被大豆胰蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶肽抑制，说明为丝氨酸蛋白酶，部分酶的氨基酸序列为IEDFPYQVDLR、ANCGGTVISEKYVLT AGHCAEGYTGLNIR、TNYASVTPITADM ICAGFPEGK、KDSCSGDSGGPLVTGGK、VVGIVSFGTGCAR、ANKPGV YSSVASAEIR，这7段肽的序列与虫草CM 01中的类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶完全一致，此纤溶酶首先降解纤维蛋白的α链，其次是β与γ链，也能将纤溶酶原激活为纤溶酶，可用于防止和治疗血栓疾病。

5 豆豉纤溶酶功能的研究及其制剂和保健品的开发

YUAN J等[35]对枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）LD-8547所产豆豉纤溶酶的体外溶栓效果进行研究，研究证明此豆豉纤溶酶对体外溶栓和抗栓有极显著疗效，且溶栓效果与豆豉纤溶酶的剂量呈正相关，毒理实验表明豆豉纤溶酶对实验小白鼠没有毒性作用，对小白鼠的角叉菜胶诱导血栓形成试验表明豆豉纤溶酶能抑制血栓的形成，且对兔子体内血栓的溶解也有显著性作用，豆豉纤溶酶能明显增加流血和凝血时间，即豆豉溶纤酶在体外和体内都有较佳的溶栓效果，可用于预防血栓和溶栓剂的临床药物开发。CHOI JH等[33]研究结果表明枯草芽孢杆菌C142的溶纤效果要强于血纤维蛋白溶酶，能水解血纤维蛋白的α和β链，但不能切断γ链，菌株C142在三个动物模型上具有抗血栓作用，在20000FU/kg的剂量下不存在出血性，可作为溶栓剂进行开发。ALBUQUERQUEW等[36]研究了一系列水平与垂直静磁场对纤溶酶的静态和动态两种溶解蛋白的效果的影响，结果静磁场对静态纤溶试验有显著性影响。KIRTANEAR等[8]得出溶纤酶的联合疗法会增加肿瘤灌注和抗癌药物的治疗疗效。WANGY J等[37]发现纤溶酶对血管内皮细胞具有保护作用。TAKAB-AYASHIT等[38]发现纤溶酶能缩小鼻息肉组织并减少粘液分泌。KIM H S等[39]研究发现，纤溶酶的添加能提高黑麦的发酵效率。陈亮[40]发现豆豉纤溶酶对芽孢杆菌中孢子的形成具有重要的作用，并有利于提高菌株对于环境的耐受性。

关于寡肽、蛋白质类药物或功能因子经口服途径，易被胃肠道酶降解、跨膜吸收率低等是限制其应用的瓶颈问题。张婵等[41-42]为提高豆豉纤溶酶口服生物利用度，采用硫酸铵梯度法建立了豆豉纤溶酶载纳米脂质体系统，豆豉纤溶酶在胃肠道的耐受能力以及在十二指肠、空肠和回肠的吸收速率常数、肠膜表观渗透系数和吸收效率均明显提高，改善了口服生物利用度。关晨晨[43]通过挤压法豆豉纤溶酶微胶囊，以海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖体系制备出微胶囊，经胃酸、胆汁酸处理后酶活114.07 IU/m L以上，对酸有很高的耐受力；经人工肠液处理35m in，微胶囊几乎全部崩解，肠溶释放率可达到97.42%。李大鹏等[44]对富含纤溶酶低盐豆酱的制曲和发酵工艺参数进行了研究，纤溶酶活性的达到1 070U/g。

6 小结

目前各国科学研究人员都在以本国动植物以及发酵食物等进行取材，进行生产纤溶酶菌株的筛选与鉴定以及纤溶酶相关性质的研究。日本的纳豆激酶广泛被世界各国科研人员研究，且已有相关的口服液和胶囊等保健品在市面销售。而我国的研究主要集中于对生产豆豉纤溶酶菌株的筛选与传统发酵工艺的优化，仍停留在初级阶段，且未见以豆豉纤溶酶为主要成分的溶栓剂等临床药品或保健品的诞生。应在筛选出高产纤溶酶菌种的基础上，对纤溶酶的酶学特性、分子结构以及作用机理等进行深层细致精准的研究，利用高新技术对纤溶酶发酵培养和分离纯化进行完善，实现纤溶酶的对于预防与治疗血栓疾病的临床应用，以及纤溶酶在其他疾病或其他领域中的应用。在应用纤溶酶的同时，将纤溶酶的发酵与中国传统食品如豆豉、虫草联系起来，结合这些食药同源食物的其他活性物质与保健成分，开发具有多功能、无副作用的高质量保健品。

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Research and application progressof fibrinolytic enzyme fro m Douchiand other microbialsource

SHEN Changxuan,WANG Xiujun*,HUANG Shan
(1.Guizhou ProvincialKey Laboratory ofFermentation Engineering and Biopharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Douchi fibrinolytic enzyme,isolated from Chinese traditional food-Douchi,isa proteasew ith fibrin dissolve effect.The research of screening andmutagenesisof strain,gene cloning and expression,optim ization of fermentation process,purification of enzymes,function and development of preparations and related preparations and health care products in recent 5 yearswere reviewed,and the presentdomestic and overseas condition of fibrinolytic enzymewere analyzed.The application prospect and development direction was expected,and the research directions of fibrinolytic enzymewas suggested.

fibrinolytic enzyme;strainsscreening;fermentation process;purification

TS201.2

0254-5071（2017）08-0006-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.002

2017-07-18

贵州省科技计划项目（黔科合支撑[2016]2537）

沈畅萱（1993-），女，硕士研究生，研究方向为食品安全与食品保藏。

*通讯作者：王修俊（1965-），男，教授，本科，研究方向为食品安全与食品保藏。