高效液相色谱法测定固体饮料中Y-氨基丁酸含量

吴蓉 周玮 何慧园

（江苏省产品质量监督检验研究院，江苏南京210000）

高效液相色谱法测定固体饮料中Y-氨基丁酸含量

吴蓉*周玮 何慧园

（江苏省产品质量监督检验研究院，江苏南京210000）

Y-氨基丁酸（Y-aminobutyric acid，GABA），又名氨酪酸或哌啶酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，在自然界中的分布极为广泛，在动植物及微生物中均有存在。GABA对哺乳动物的中枢神经系统具有抑制作用，能参与多种代谢活动，具有重要的生理功能。GABA在人体内作为神经传导的主要介质，具有促进血管扩张降血压、促进睡眠增强记忆力、镇静神经抗焦虑、预防及治疗癫痫病、加强脑代谢预防老年痴呆症等作用。在上世纪80年代，日本利用植物富集法首次研发了GABA茶功能性食品。随后，富含GABA的发芽糙米实现了商业化生产。目前，GABA已被广泛地应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味品等食品中，开发出各种适合不同人群及年龄段的产品，具有极其广阔的发展前景。

目前国内外关于GABA的测定方法主要有比色法、氨基酸分析仪法、薄层扫描法、放射性受体法、高效液相色谱法等。由于GABA对电化学、紫外、可见光及荧光的响应强度低，直接测定非常困难，需要将其衍生化处理后再测定，因此，柱前衍生-高效液相色谱法已成为测定GABA的主要方法。近年来，常用的GABA衍生化方法主要有法丹磺酰氯（DNS）法、2,4-二硝基氟苯（FDNB）法、6-氨基喹琳基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二甲醛（OAP）法。由于FDNB毒性太强、灵敏度低，AQC价格昂贵，OAP反应不稳定且数据重现性差，因此采用DNS作为GABA测定的衍生化试剂。与传统的DNS法相比，本试验优化了DNG的使用浓度，节约了成本，提高了回收率。本文旨在以DNS为衍生化试剂，建立一种能够快速、准确地测定固体饮料中GABA含量的高效液相色谱分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

固体饮料，南京市生产厂家。

硼酸，分析纯，南京化学试剂一厂；丹磺酰氯，纯度≥98%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；冰乙酸，优级纯，南京化学试剂有限公司；氢氧化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙酸钠，分析纯，苏彤化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯，德国默克股份两合公司；甲醇，色谱纯，德国默克股份两合公司；水，超纯水；Y-氨基丁酸，纯度≥99%，SIGMA公司。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；2996二极管阵列检测器，美国Waters公司；XS 205DU电子分析天平，美国梅特勒-托利多仪器公司；XW-80A混合涡旋仪，上海青浦泸西仪器厂；SB25-12DTDN超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备

准确称取0.1 g（精确至0.000 1 g）GABA，用超纯水溶解并定容至10 mL，经超声波溶解后，振荡混匀，配制成质量浓度为10 mg/mL的标准溶液。用超纯水按上述步骤将10 mg/mL的标准溶液逐级稀释成0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL的标准溶液，备用。

1.3.2 样品溶液的制备

准确称取0.05 g～0.50 g粉碎试样（精确至0.000 1 g），用纯水溶解并定容至100 mL，经超声波溶解后，振荡混匀，用孔径0.22 μm滤膜过滤，收集滤液，作为衍生化样品溶液，备用。

1.3.3 硼酸缓冲溶液的制备

准确称取2.47 g硼酸（精确至0.000 1 g），加纯水80 mL超声溶解，用氢氧化钠溶液将pH调至10.2，并用水定容至100 mL，配制成0.4 mol/L的硼酸缓冲溶液。

1.3.4 DNS衍生液的制备

准确称取15mgDNS，用乙腈溶解并定容至10mL，经超声波溶解后，振荡混匀，配制成1.5 mg/mL的DNS溶液。避光保存，现配现用。

1.3.5 柱前衍生化反应

准确吸取1.3.2中的样品溶液50μL，加入150μL 0.4 mol/L硼酸缓冲溶液和300 μL 1.5 mg/mL的DNS衍生液，涡旋混匀，静置反应2 min后，过孔径0.22 μm滤膜，进样。标准溶液同步衍生化，步骤同上，标准溶液衍生后的质量浓度分别为0.002 5 mg/mL、0.005 mg/mL、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL。

1.3.6 高效液相色谱分析条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 μm× 150 mm，5 μm）；流动相：流动相A为25 mmol/L的乙酸钠溶液，用2%的醋酸调pH值至6.0±0.2；流动相B为乙腈；等度洗脱，其中A∶B=68∶32；流速1 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL；检测波长216 nm。

1.4 数据分析

HPLC色谱图采用Waters Empower工作站采集，使用Empower 2 Software软件对试验数据进行统计分析，Origin 8.0进行绘图制作。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择及优化

依据相关文献报道，GABA的测定可以采用乙酸钠-乙腈或磷酸缓冲溶液-甲醇为流动相，但其方法均采用梯度洗脱程序，不仅基线不稳而且洗脱时间长。因此，本试验在现有的基础上进行改进，采用等度洗脱，以25 mmol/L的乙酸钠溶液（pH=6.0）-乙腈为流动相，该方法准确度高，且基线噪音小，能达到有效地分离效果。试验结果表明，当乙酸钠溶液与乙腈的体积比调至68∶32，可以在15 min内有效地分离GABA，GABA标准溶液色谱图如图1所示，保留时间为6.4 min，分离效果良好。

图1 GABA标准品色谱图

2.2 最大吸收波长的确定

为了提高方法的灵敏度，选择合适的检测波长至关重要。本试验采用0.1 mg/mL的GABA标准溶液，按1.3.5进行衍生化反应，与没有添加GABA标准溶液的空白液做对比，结果见图2。经光谱分析后，GABA有3个最大吸收波长。同一浓度不同波长下的GABA标准品色谱图如图3所示，由响应强度分析可得，取GABA衍生物的最大吸收波长216 nm为最适检测波长。

2.3 GABA的定性分析

在1.3.6的色谱条件下，采用1.3.5的方法，对没有添加GABA标准溶液的空白液、样品溶液及标准溶液分别进行衍生化反应，色谱图见图4。由图4可知，GABA的保留时间为6.4 min，基线平稳，分离效果好，杂质峰对目标物的测定无干扰。

图2 GABA衍生物的紫外光谱图

图4 空白衍生液（A）、标准品（B）和样品（C）的色谱图

2.4 标准溶液曲线的绘制

将质量浓度分别为0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL的GABA标准溶液按1.3.5进行衍生化反应，在1.3.6的色谱条件下测定，以峰面积为纵坐标Y，衍生后标准溶液质量浓度为横坐标X（mg/mL）绘制标准曲线，所得线性回归方程为Y=6.741 1×106X-7 970.3，回归系数R2=0.999 5。结果表明，GABA的质量浓度在0.002 5 mg/mL～0.1 mg/mL之间时，利用本试验方法测定的结果呈现良好的线性关系，以3倍信噪比（S/N=3）计算检出限为2.514 ng，标准曲线见图5。

图5 标准曲线线性方程

2.5 精密度试验

对同一种固体饮料进行平行试验共6次，计算样品中GABA的平均值、标准偏差及相对标准偏差（RSD），试验结果见表1。由表1可知，GABA衍生物峰面积的RSD为0.89%，GABA质量浓度的RSD为0.89%。

表1 精密度试验结果

2.6 回收率试验

分别称取同一质量浓度的固体饮料样品3份，按照样品溶液中GABA质量浓度的80%、100%、120%进行加标试验，按照1.3.6的色谱条件及1.3.5的试验方法，测定样品中GABA的质量浓度，计算回收率、平均回收率及相对标准偏差（RSD），结果如表2所示。由表2可知，本试验方法的回收率在96.00%～102.39%之间，相对标准偏差（RSD）在0.80%～2.87%之间。

表2 回收率试验结果

3 结论

GABA在自然界中分布广泛，但在不同物质中的含量差别较大。本试验采用柱前衍生-高效液相色谱法测定固体饮料中GABA的含量，在传统的DNS法基础上，采用等度洗脱，实现样品与衍生化试剂的快速分离；选择最优检测波长，提高灵敏度；优化DNS的浓度，提高回收率。OAP作为一种广谱的衍生化试剂，近年来被广泛采用，但其稳定性较差，因此，本方法采用DNS作衍生化试剂，不仅能达到OAP的效果，而且能弥补其存在的不足。同时与FDNB法及AQC法相比较，该方法成本低、衍生化过程简单、检测线性范围广、精密度高且重现性好。采用本方法测定固体饮料中的GABA，回收率范围在96.00%～102.39%之间，为后续食品中GABA的测定提供了有力的平台，也为GABA的测定奠定了应用基础。

［1］杨胜远，陆兆新，吕风霞，等.γ-氨基丁酸的生理功能和研究开发进展［J］.食品科学，2005，26（9）: 546-551.

［2］程威威，周婷，吴跃，等.高效液相色谱法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量［J］.食品科学，2014，35（12）:98-101.

［3］PATIL S B，KHAN M K.Germinated brown rice as a value added rice product:A review［J］.Journal of Food Science and Technology Mysore，2011，48（6）: 661-667.

［4］DEFEUDIS F V.γ-Aminobutyric acid and cardiovascular function［J］.Experientia，1983，39（8）:845-849.

［5］杨藻宸.药理学和药物治疗学［M］.北京：人民卫生出版社，2000.

［6］PERRY T L，HANSEN S.Amino acid abnormalities in epileptogenic foci［J］.Neurology，1981，31（7）:872-876.

［7］OKADA T，SUGISHITA T，MURAKAMI T，et al.Effect of the defatted rice germ enriched with GABA for sleeplessness，depression，autonomic disorder by oral administration［J］.Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi，2000，47（8）:596-603.

［8］LEVENTHAL A G，Wang Y，Pu M，et al.GABA and its agonists improved visual cortical function in senescent monkeys［J］.Science，2003，300（5 620）:812-815.

［9］宋伟，马霞，张柏林.γ-氨基丁酸的生理功效及其在乳品中的强化途径［J］.乳业科学与技术，2008，31（6）:297-302.

［10］陈恩成，张名位，彭超英，等.比色法快速测定糙米中γ-氨基丁酸含量研究［J］.中国粮油学报，2006，21（1）:125-128.

HPLC analysis of Y-am ino butyric acid in solid beverages

WURong*ZHOUWei HE Huiyuan
（Jiangsu province product quality supervision and inspection institute，Jiangsu Nanjing210000，China）

建立了一种快速准确地测定固体饮料中Y-氨基丁酸含量的高效液相色谱分析方法：采用丹磺酰氯（Dansyl-Cl）为柱前衍生化试剂，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18，流动相为25 mmol/L乙酸钠（pH=6.0）和乙腈的混合溶液（体积比为68∶32），流速为1.0 mL/min，柱温30℃，等度洗脱，紫外检测波长216 nm。结果表明，该方法的线性范围为0.002 5 mg/mL～0.1 mg/mL，R2=0.999 5，线性关系良好，检出限2.514 ng，平行试验6次，Y-氨基丁酸质量浓度的相对标准偏差（RSD）为0.89%，3个不同浓度的加标回收率在96.00%～102.39%之间，回收率相对标准偏差（RSD）在0.80%～2.87%之间。与传统的试验方法相比，该方法具有基线稳定，灵敏度高，线性范围广，回收率高及重现性好等特点。

固体饮料；Y-氨基丁酸；高效液相色谱；丹磺酰氯

A fast and accurate high performance chromatography method was developed for the determination of Y-aminobutyric acid(GABA)in the solid beverages,by precolumn derivatization with dansyl chloride(Dansyl-Cl).The samples were separated on a Agilent Eclipse XDB-C18at 30℃using 25 mmol/L sodium acetate:acetonitrile(pH=6.0) =68:32 as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min,isocratic elution,inspected by ultraviolet detector at 216 nm.The results showed that the Y-aminobutyric acid(GABA)has a good linear relationship at 0.002 5 mg/mL～0.1 mg/mL,the peak area with correlation coefficient at 0.999 5,and the detection limit was 2.514 ng.The relative standard deviation (RSD)of the mass concentration ofsix times was 0.89%for Y-aminobutyric acid(GABA).The three different concentrations of recoverywas 96.00%～102.39%,and the relative standard deviation(RSD)was 0.80%～2.87%.Compared with the traditional experimental methods,utilizing isocratic elution,optimizing the detection wavelength and derivatization regent,the method has a stable baseline，high sensitivity，wider linear range，higher recoveryand reproducible.

solid beverages；Y-aminobutyric acid；HPLC；dansyl-Cl

TS278

A

1673-6044（2016）04-0059-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.04.016

*吴蓉，女，1990年出生，2014年毕业于南京农业大学环境工程专业，硕士，助理工程师。

2016-11-16