LAMP技术在动物源性食品安全检测中的应用

边忠博，孙如一，王磊，张一，杨柳，陈宇飞*

(1.吉林工商学院 食品工程学院，长春 130507；2.吉林农业大学 生命科学学院，长春 130118)

3 LAMP技术在动物源性食品病原菌检测中的应用

4 LAMP技术在动物源性成分检测中的应用

LAMP技术在动物源性食品安全检测中的应用

边忠博1，孙如一2，王磊1，张一1，杨柳1，陈宇飞1*

(1.吉林工商学院 食品工程学院，长春 130507；2.吉林农业大学 生命科学学院，长春 130118)

近年来，动物源性食品安全问题时有发生，急需发展快速、高效的检测技术。环介导等温扩增技术是一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，因其具有特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点，可以在动物源性食品安全检测中应用。文章针对环介导等温扩增技术在动物源性食品病原菌检测、动物源性成分检测两个方面的应用进行综述，分析LAMP技术的应用优势，旨在为更好地解决动物源性食品安全问题提供帮助。

动物源性食品；LAMP技术；致病菌；成分；检测

1 概述

动物源性食品是指来源于猪、牛、羊、禽、马属动物、犬、兔、蜜蜂及水产类动物的可供人食用的肉、乳、蛋及制品和副产品[1]。随着人们生活水平的提高和膳食结构的改变，动物源性食品的消费量日益增大[2]。近年来，动物源性食品安全问题时有发生，此问题已受到国家政府的重视，引起广大人民群众的高度关注和共识[3]。

本文针对环介导等温扩增技术在动物源性食品病原菌检测、动物源性成分检测两个方面的应用进行综述，分析LAMP技术在动物源性食品安全检测中应用的优势，旨在为更好地解决动物源性食品安全问题提供帮助。

2 环介导等温扩增方法

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的体外扩增特异脱氧核糖核酸片段的分子生物学技术，是由Notomi等于2000年建立的[4]。

LAMP技术主要针对靶基因序列的6个不同区域，设计1对外引物F3和B3、1对内引物FIP和BIP，加入具有链置换作用的DNA聚合酶，在60～65 ℃范围内，对DNA 片段特异性基因序列上的6个独立区域进行扩增，反应过程中会产生白色的焦磷酸镁沉淀[5]。

环介导等温扩增技术因具有特异性强、检测速度快、检测灵敏度高、可实现更加清晰的可视化检测、可脱离仪器、实现现场检测等优点[6]，目前已用于动物源性食品病原菌检测、动物源性成分检测等领域。

3 LAMP技术在动物源性食品病原菌检测中的应用

对人体危害严重的动物源性食品病原菌主要有肉毒杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌等[7]。

3.1 肉毒杆菌检测

肉毒杆菌作为一种致病菌，能引起中毒症，由于它具有厌氧生长、低温生长产毒的特点，使其在日前普及的真空包装、冷冻食品及罐装食品中具有生长优势，从而成为这类食品中毒的主要原因之一[8]。

陈宇飞等对经过加工的熟肉类宠物食品进行研究，建立了宠物食品中肉毒杆菌LAMP检测方法，建立的LAMP反应体系只扩增肉毒杆菌基因，特异性好，体系的最佳反应温度为64 ℃，最佳反应时间为60 min，最低检测浓度为0.0001 pg/μL，比PCR高出10倍。

3.2 沙门氏菌检测

沙门氏菌是公共卫生学上有重要意义的人畜共患病原菌之一，可导致人类感染和食源性中毒[9]。

宠心怡等应用环介导等温扩增技术建立了一种快速、高效、灵敏的肉中沙门氏菌检测方法，检测灵敏度为普通PCR的100倍，达到了9.8×102cfu/mL。

唐梦君等[10]建立了检测鸡蛋中沙门氏菌的LAMP方法，检测沙门氏菌纯培养物的灵敏度为1.04×102cfu/mL，应用该方法对扬州市场上销售的鸡蛋沙门菌检测，检测结果与传统培养方法相符，并且检测特异性强，耗时短。

王羽等[11]采用环介导等温扩增技术检测肉制品中的沙门氏菌，对香肠、猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉等制品进行检测，检出率达91.6%，与国标相比，符合率为93.8%。

3.3 单增李斯特菌检测

单增李斯特菌是一种人畜共患食源性致病菌，可使人畜患脑膜炎、心肌炎、败血症、早产等疾病，危害较大[12]。

陈洵等[13]研究了环介导恒温扩增法检测生肉及熟肉制品中的致病微生物，建立的检测试剂盒可检出肉制品中的单增李斯特菌，对其他近源菌株检测呈阴性结果，检出限达1.81×103cfu/mL。

3.4 布鲁氏菌检测

布鲁氏菌病作为一种人兽共患传染病而广泛分布，既可感染人类，又可感染经济动物，如猪、羊、牛、鹿等，对人或牲畜的健康、国民经济的发展以及国家安全等都能构成严重的威胁[14]。

谢文萍等[15]应用环介导等温扩增技术，针对布鲁氏菌保守基因设计LAMP引物，通过浊度法对LAMP反应条件进行了优化，结果显示：浊度法的最低检测限为4.36 fg/μL，灵敏度高于普通PCR的最低检出限4.36 pg/μL。

蔺国珍[16]建立了可以快速检测布鲁氏菌的环介导等温扩增方法，通过对血样和奶样进行检测，共检测出了6个种的布鲁氏菌病原，最低检测限度达到了9 fg/μL，与PCR方法进行比较，高出了10倍。

3.5 金黄色葡萄球菌检测

金黄色葡萄球菌是人和动物的重要病原菌之一，同时也是食物中毒的常见致病菌之一[17]。

蔡克周等[18]采用环介导等温扩增技术，检测猪血中金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌通过LAMP方法检测，灵敏度达到了8.7 cfu/mL，对猪血中金黄色葡萄球菌进行检测，检出限达到8.7×102cfu/mL，而利用PCR法进行检测，检出限为8.7×103cfu/mL，该方法具有较高的特异性和敏感性。

徐义刚等[19]建立了食品中金黄色葡萄球菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法，并对958份鸡肉制品、牛肉制品、奶粉、鸡蛋制品等样品、人工污染样品进行了检测，对污染食品的金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为42 cfu/mL，40～60 min内即可完成检测。

3.6 LAMP技术用于动物源性食品病原菌检测的优势

LMAP技术用于食品病原菌检测，克服了传统检测方法操作繁杂、检测周期长的缺点，检测时间通常可在60 min内，最长90 min 内完成，如果在反应中添加了环引物，那么反应时间将会缩短至30～45 min。与PCR检测方法相比，LAMP技术用于食品病原菌检测，具有更高的灵敏度。同时，环介导等温扩增技术因为操作简单，而且不需要配备昂贵的仪器设备，在使用配套试剂盒时，仅需要配置一台水浴锅即可完成检验，特别适合食品检验机构、出入境、边远地区进行动物源性病原菌检测。

4 LAMP技术在动物源性成分检测中的应用

由于肉、奶等生肉及熟肉类食品中“掺杂使假”的投诉事件不断上升，疯牛病的传播风险也在不断加大，作为保障食品安全、维护消费者利益的重要技术手段，食品和饲料中动物源性成分的定性或定量检测技术已成为国内外的研究热点[20]。

4.1 牛源性成分检测

徐淑菲等[21]建立了牛源性成分LAMP检测方法，试验结果表明：该方法灵敏度比PCR方法高100倍，达到5.408×10-2μg/μL，反应时间短，最快在10 min即可完成。

冼钰茵等[22]建立了肉及肉制品中牛源性成分的环介导等温扩增技术，对市售的9种生牛及美味孜然牛肉、芝麻牛肉、手撕风干牛肉3种熟肉类制品进行对比检测，结果表明：该方法生肉及熟肉类制品中牛源性成分检测都具有高灵敏度、高特异性。

4.2 羊源性成分检测

徐淑菲等根据羊cytB基因设计3对特异性引物，动物GenieⅡ等温扩增荧光检测系统，以LAMP检测方法为基础，建立了检测羊源性成分的LAMP方法，检测灵敏度可达到5.928×10-3μg/μL。

4.3 狐狸源性成分检测

刘少宁等[23]建立了一种能够快速区分出绵羊肉中掺入狐狸源性成分的环介导等温扩增方法，可检测出掺假率为1.0%的羊肉制品，最低检测浓度为2×10-4ng/μL。

4.4 鸡、鸭源性成分检测

杨丽霞等[24]建立了生肉及熟肉制品中鸡、鸭源性成分的特异性基因LAMP可视化快速检测方法，最低检出限为1 pg，对肉制品中目标物检测的检出限可达到0.01%。

4.5 猪源性成分检测

李向丽等[25]基于LAMP法对市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串进行了猪源性成分、鸭源性成分和羊源性成分检测分析，检测灵敏度达0.5%。

4.6 LAMP技术用于动物源性成分检测的优势

LAMP检测方法中核酸扩增结果与常规的PCR检测方法进行比较，具有更高的特异性。因为在反应体系中添加了钙黄绿素，反应后可产生绿色的荧光，可以实现可视化检测，使实验结果更清晰。LAMP技术开发的配套试剂盒，使得动物源性成分检测更便捷、更适合在现场进行快速检测。

5 结语

在动物源性食品病原菌检测和动物源性成分检测中应用环介导等温扩增技术，并开发配套试剂盒，可以减少检测时间，使检测过程更简便，突破动物源性食品检测灵敏度低、检测周期长、仪器设备昂贵等技术瓶颈，可广泛应用于出入境检验检疫局、食品安全监管部门、基层等进行动物源性食品安全检测。

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ApplicationofLAMPTechniqueinAnimalDerivedFoodSafetyDetection

BIAN Zhong-bo1, SUN Ru-yi2, WANG Lei1, ZHANG Yi1, YANG Liu1, CHEN Yu-fei1*

(1.School of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Changchun 130507, China;2.College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The problem of animal derived food safety has occurred occasionally in recent years.The fast and efficient detection technique is in urgent need.The loop-mediated isothermal amplification is a new molecular biological technique which can amplify specific DNA fragments in vitro.This technique can be applied in animal derived food safety detection because of its strong specificity, high sensitivity and fast testing speed.The application of LAMP in animal derived food pathogenic bacteria and animal derived ingredients detection are summarized.The advantages of application of LAMP technique are analyzed, which can provide help for solving the problem of animal derived food safety better.

animal derived food；LAMP technique；pathogenic bacteria；component；detection

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.028

1000-9973(2017)11-0127-03

2017-05-20 *通讯作者

中国农业部重点实验室2016开放基金；吉林省科技厅2015年重点科技攻关项目(20150204064NY)；吉林工商学院重点实验室基金项目([2016]第005号)

边忠博(1984-)，男，吉林长春人，讲师，研究方向：食品加工及检测；

陈宇飞(1968-)，男，吉林松源人，教授，研究方向：食品安全检测。