中国兽医药品监察所OIE猪瘟参考实验室猪瘟研究进展

王 琴，赵启祖，徐 璐，张乾义，邹兴启，朱元源，宁宜宝，李 翠，范学政

（中国兽医药品监察所，OIE猪瘟参考实验室，北京 100081）

研究进展

中国兽医药品监察所OIE猪瘟参考实验室猪瘟研究进展

王 琴，赵启祖，徐 璐，张乾义，邹兴启，朱元源，宁宜宝，李 翠，范学政

（中国兽医药品监察所，OIE猪瘟参考实验室，北京 100081）

中国兽医药品监察所国家猪瘟参考实验室是由农业部2002年公布的第一批国家参考实验室，2017年6月1日，世界动物卫生组织（OIE）确认中国兽医药品监察所猪瘟实验室成为新的OIE猪瘟参考实验室，该实验室是国内最早开展猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）研究的权威实验室之一。按照国家重大动物疫病防控的需求以及OIE 参考实验室职能的要求，该实验室近年来承担了近22项国家和省部级的研究课题，研究经费达2 000万元。开展了我国猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSF V）的分子流行病学研究、猪瘟流行病学监测和信息系统数据库建设、猪瘟新型诊断试剂的研发、猪瘟标准品和参照品的制备和标定、猪瘟新型疫苗的研发、相关基础研究和猪瘟综合防控和净化技术研究，取得了重要的进展。简要总结如下：

1 我国猪瘟流行病学及数据库研究

猪瘟病毒分子流行病学研究的科学意义，在于实时跟踪CSFV的变异特征及抗原性变异程度，监测新的CSFV流行毒株的情况和疫苗对流行毒株的有效性。通过分析我国自1979年到2016获得和收集的868条E2基因主要抗原区域序列（190 bp）(含中国台湾地区的49条)，中国流行的CSFV分属为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个基因型，1.1、2.1、2.2、2.3 和3.4五个基因亚型。经分析中国大陆的819条E2基因序列，74.24%属于基因Ⅱ型，其中2.1亚型为499条，占60.93%；1.1亚型为211条，占25.76%；其他为少量的2.2和2.3亚型分别为93条（11.36%）和16条（1.95%）；中国台湾地区存在基因Ⅲ型。全国各省市自治区均存在基因Ⅱ型，表明基因Ⅱ型在中国CSF流行中占绝对优势，属优势基因型。序列比对分析研究还发现中国CSFV流行株基因组在37 年间处于稳定状态。监测结果还表明，到目前为止，中国大陆一直没有监测到基因Ⅲ型的传入与流行，但周边国家及中国台湾地区存在其他亚型毒株，如韩国存在3.2亚型、泰国存在3.3亚型、中国台湾和日本存在3.4亚型毒株。因此，要警惕周边国家及地区的新亚型流行毒株传入我国大陆。

我们采用上述CSFV流行病学数据，与数据库、GIS（地理信息系统）、生物信息学技术相结合，创建了我国第一个猪瘟流行病学信息系统（CSFinfo），包含1 000株中国流行毒株、868条CSFV E2基因序列和其他序列，成为全球继德国之后第二个拥有这种数据库的国家。对CSFV流行病学监测提供了重要技术平台，为政府提供可靠的疫情资料。

2 猪瘟诊断技术

准确、特异和快速的实验室诊断技术是猪瘟防控的重要手段，病原学检测技术方面，我国OIE猪瘟参考实验室采用自主研发的CSFV E2单克隆抗体优化和完善了CSFV分离培养技术、荧光抗体检测技术、免疫过氧化物酶检测技术和体外病毒中和试验；研制了CSFV通用荧光RT-PCR诊断试剂盒、CSFV MGB鉴别荧光RTPCR诊断试剂盒和CSFV套式RT-nPCR 诊断试剂盒3种CSFV核酸诊断试剂盒，用于CSF疫情监测、强弱毒鉴别诊断、分子流行病学调查；研制了猪瘟兔化弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒，用于疫苗中间产品效力检验的动物实验替代方法及原材料中牛病毒性腹泻病毒的检测，为疫苗质量安全提供技术保障；还研发了CSFV QuantiGene ViewRNA原位杂交检测方法，可用于CSFV RNA在易感细胞中的复制规律进行研究和临床诊断。所有病毒核酸诊断试剂盒的敏感性均高于商品化的国外ELISA抗原检测试剂盒，特异性好。只要根据CSF的临床特征，合理地采用适当的方法，完全可以通过实验室诊断达到确诊CSF的目的。

在我国，通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的保证，也是评价疫苗免疫效果的重要技术手段。OIE猪瘟参考实验室采用杆状病毒表达的CSFV E2蛋白原创性研发的CSFV间接ELISA抗体检测试剂盒，较国外产品具有更高的敏感性、适用性和实用性，解决了长期使用国外同类产品费用高昂的困境，更合适中国目前全面普免的抗体普查，是我国第一个获得新兽药证书的猪瘟抗体检测ELISA制品；采用E2蛋白和自制的CSFV E2单克隆抗体原创性地研发了CSFV阻断ELISA抗体检测试剂盒，解决了CSFV间接ELISA抗体检测试剂盒特异性较差的问题，同时敏感性高于同类产品；随着科学技术的发展，将灵敏的化学发光分析技术结合竞争ELISA原理，建立了猪瘟病毒化学发光抗体检测试剂盒，进一步提升了猪瘟病毒ELISA技术的敏感性和特异性。采用上述E2单抗完善了OIE推荐的方法：猪瘟病毒荧光抗体病毒中和试验（Neutralization-immunofluorescence，NIF）和猪瘟病毒过氧化物酶联中和 试 验（Neutralization peroxidaselinked antibody，NPLA）。

目前，我国OIE猪瘟参考实验室不但建立、完善、使用并推广OIE手册确认的猪瘟诊断技术，还自主研发了一系列的猪瘟新型诊断技术。建立了病毒标准库、血清标准库和单抗标准品库，发布了2项国家标准，并制定了系统的实验室诊断标准操作程序（SOP）。2009年至2016年，我实验室6次参加了OIE/欧盟CSF参考实验室（EUCSFRL）组织的来自42个国家50个实验室的CSF诊断能力比对试验（ILCT），达到欧盟标准。实验室已具备OIE要求的诊断能力，人员技术水平和操作技能也达到OIE要求。部分诊断方法被推荐为2011-2017年国家猪瘟免疫和监测方案使用方法。

至此，我实验室在CSF诊断、疫情监测、分子流行病学分析等所需的检测方法已经系统建立，突破了我国猪瘟诊断试剂长期依赖进口的状态，标志着我国的猪瘟诊断技术达到国际先进水平，提升了中国CSF诊断技术在国际上的认可，为其防控和净化扫清了障碍。

3 其他研究进展

近年来我实验室成功研发出了猪瘟传代细胞疫苗，通过对C-株疫苗再评价研究，分子流行病学研究结合动物免疫保护实验证实了现用C-株疫苗对我国流行毒株（Ⅰ和Ⅱ型）能实施有效保护，来自英国APHA的数据显示C-株疫苗对基因Ⅲ型也能提供完全保护，为我国继续使用猪瘟兔化弱毒疫苗进行全面免疫提供了重要科学依据，为坚持我国政府制定的100%强制免疫策略奠定了科学理论基础，否定了多年来提出的“由野毒株变异引起免疫失败”的学术争端。正在开展DIVA疫苗和E2亚单位疫苗等新型疫苗的研究。

还在猪瘟慢性感染与免疫机制、猪瘟病毒和RNA在感染猪体内的分布和C-株减毒分子机制等基础研究方面取得了重要的进展。阐明了感染与免疫的分子机制，发现了猪瘟病毒致弱的区域。

根据中国猪瘟流行特点，在国家“十一五”科技支撑计划的支持下，对我国部分示范养猪场CSF净化的成功先例表明，在我国目前猪病流行状态下，在规模化猪场和部分区域开展CSF的净化并逐步对其根除是完全可行的。构建了符合我国国情规模化猪场的CSF净化模式，制定了系列《规模化猪场猪瘟净化技术指南》、《集约化、规模化猪场生物安全体系的实施方案》方案和指南，取得重要创新性成果，为规模化猪场猪瘟净化提供了技术措施。

2017-11-02）