PTTG沉默通过下调糖酵解相关酶抑制卵巢癌细胞增殖

王 秀，杨爱君，蔡凤梅，王海燕，冯 燕

(1.西安市第四医院妇产科；陕西 西安 710004；2.西安交通大学附属第一医院妇产科；陕西 西安 710061)

PTTG沉默通过下调糖酵解相关酶抑制卵巢癌细胞增殖

王 秀1，杨爱君1，蔡凤梅1，王海燕2，冯 燕1

(1.西安市第四医院妇产科；陕西 西安 710004；2.西安交通大学附属第一医院妇产科；陕西 西安 710061)

目的 探讨原癌基因垂体肿瘤转化基因(PTTG)对卵巢癌细胞增殖的影响及其机制。方法 收集西安市第四医院医院2010至2013年有完整病例资料的卵巢癌手术患者病理标本68例。通过免疫组织化学和Western blotting方法，从组织和细胞水平检测PTTG与有氧糖酵解相关酶包括己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶2(PKM2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)和葡萄糖转运子1(GLUT-1)表达水平间的关系；利用慢病毒干扰载体下调PTTG表达，建立PTTG沉默的稳定卵巢癌细胞株，通过MTT、软琼脂糖克隆实验检测细胞的增殖能力改变；Western blotting检测PTTG沉默后有氧糖酵解相关酶和葡萄转运子的表达水平变化，并探讨其内在机制。结果 通过组织和细胞水平检测发现，PTTG的表达水平与有氧糖酵解相关酶HK、PFK、PKM2、LDHA及GLUT-1表达水平呈正相关性(相关系数r=0.839～0.987区间，均P<0.01)，慢病毒干扰载体沉默PTTG后，卵巢癌细胞的增殖能力显著受到抑制，有氧糖酵解相关酶的表达水平也显著下降(干扰前后灰度2.212±0.36 vs 0.782±0.18，t=2.36，P<0.01)。Western blotting检测正常卵巢及卵巢癌组织PTTG、LDHA、PKM2和GLUT-1的表达情况，结果与免疫组化结果相一致，即在正常的卵巢组织中PTTG表达微弱(灰度为0.705±0.13，n=13)，而在卵巢癌组织中呈现高表达(灰度为2.616±0.33，n=58)，并与卵巢癌组织的恶性分化呈正相关性(Pearson检验r=0.908，P=0.012)。结论 PTTG可能通过降低有氧糖酵解反应过程中的相关调节酶的表达水平，而实现其抑制有氧糖酵解代谢的作用，从而抑制卵巢癌细胞的快速增殖。

卵巢癌；垂体肿瘤转化基因；有氧糖酵解；细胞增殖

卵巢癌是仅次于宫颈癌和子宫内膜癌的第三大妇科恶性肿瘤，死亡率高达50%，五年存活率仅为30%，主要原因在于患者大部分为中晚期，术后复发率高及肿瘤的化疗耐药，然而肿瘤复发和耐药与卵巢癌细胞的快速增殖密切相关[1]。肿瘤细胞代谢转变即以正常组织细胞的氧化磷酸化为主的代谢转变为以有氧糖酵解为主的代谢；肿瘤细胞快速增殖所必须的大分子物质包括氨基酸、核酸和磷脂则主要来源于细胞有氧糖酵解的中间产物。这种代谢转变是肿瘤发生、发展最为基础的生物活动，其中关键性的癌基因在代谢转变过程中具有重要作用[2-4]。

垂体肿瘤转化基因(pituitary tumor transforming gene，PTTG)是Pei等1997年首次采用差异显示PCR等分子生物技术分离出的新型原癌基因。该基因在多种恶性肿瘤组织中均呈高表达，包括乳腺癌、直肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、甲状腺癌及中枢神经系统肿瘤等。PTTG在正常卵巢组织弱表达，或检测不到，但在卵巢癌组织中的表达水平与肿瘤组织的分化程度呈正相关[5]。在细胞水平的研究发现，原癌基因PTTG具有安全素样作用，参与细胞分裂过程中姐妹染色体的分离，DNA的修复，细胞周期调控，细胞分化以及器官发育等多种生物功能[6]。对其上游作用因子的研究发现，成纤维细胞生长因子b(fibroblast growth factor b，bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、胰岛素、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)等多种生长因子可通过磷脂酰肌醇三磷酸激酶信号通路(phosphatidylinositol triphosphate signal pathway，PI3K/AKT)或丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联途径影响PTTG的生物功能，涉及肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、转移、肿瘤血管形成和肿瘤上皮细胞的间质转变(epithelial mesenchymal transition，EMT)[7-8]。

近年来研究发现肿瘤细胞主要以糖酵解作为主要的代谢方式，即使在氧气充足的情况下仍旧以糖酵解为主要的代谢途径，而其线粒体的氧化磷酸化代谢存在缺陷或不同程度的供能异常，该现象被称为有氧糖酵解或Warburg效应。癌基因PTTG对卵巢癌细胞糖酵解代谢的作用目前尚不清楚。据此，本文收集了卵巢癌及正常卵巢的组织标本，通过组织水平和细胞水平的实验，探讨PTTG对卵巢癌细胞增殖的影响，卵巢癌与正常卵巢组织间PTTG和糖酵解相关酶表达差异，并分析卵巢癌中PTTG与糖酵解相关酶之间的关系。

1资料与方法

1.1临床病例资料

13例正常卵巢组织标本和97例卵巢癌标本均收集于西安市第四医院，见表1。

1.2卵巢癌细胞株

人卵巢癌细胞株：A2780、SKOV-3、HO-8910和OVCA433购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(Chinese Academy of Sciences Typical Culture Preservation Committee Cell Bank，CASTCPCCB)，培养保存于西安交通大学医学院环境与遗传实验室。本实验中所有使用细胞的传代次数不超过50代。

1.3实验方法

1.3.1免疫组织化学染色和 Western blotting检测

应用组织学染色方法(HE染色、免疫组织化学染色)和 Western blotting检测法对正常卵巢组织、卵巢癌组织和卵巢癌细胞中PTTG及参与有氧糖酵解代谢过程的几个关键性酶进行检测，包括己糖激酶(hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)、丙酮酸激酶2(pyruvate phosphokinase，PKM2)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase，LDHA)和葡萄糖转运子1(Glucose transporter 1，GLUT-1)。

1.3.2 Western blotting实验、细胞增殖检测、软琼脂克隆形成实验

按照分子生物学实验学方法进行Western blotting实验、细胞增殖检测(MTT法)、软琼脂克隆形成实验[9]。

1.3.3 RNA干扰

应用RNA干扰方法，设计针对PTTG的干扰片段，筛选干扰效果最佳的siRNA，构建PTTG慢病毒干扰载体，沉默原癌基因PTTG，建立PTTG干扰的稳定转染的细胞株(PTTG-shRNA 卵巢癌细胞株)，通过MTT和克隆形成实验检测细胞干扰后的增殖能力、克隆形成能力的改变。

1.4统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件对实验结果进行分析，组间分析采用Two-way ANOVA分析。 PTTG表达强度与病理分级，PTTG表达水平与LDHA、PKM2、GLUT-1表达水平的相关性用Pearson检验进行分析，以P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1病例详细资料

收集西安市第四医院医院2010至2013年有完整病例资料的卵巢癌(组织学类型均为上皮性卵巢癌)手术患者病理标本68例。全部病例术前均未接受放、化疗。纳入病例的详细资料见表1：上皮性卵巢癌共68例，年龄在23～72岁之间，中位年龄是53岁。组织学分化特征：其中浆液性腺癌32例，粘液性腺癌18例，子宫内膜样腺癌12例，透明细胞癌6例。根据国际妇产科联合会(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)指南2012版手术病理分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期6例，Ⅲ期51例，Ⅳ期7例。除Ⅰ期中2例患者因年轻行保守性手术外，Ⅳ期7例患者行姑息性肿瘤细胞减灭术外，其余患者均实施了规范的卵巢癌手术分期手术(包括全子宫、双侧附件、大网膜、阑尾切除加盆腔淋巴结清扫术)。另外，选取13例正常卵巢组织标本(从Ia期宫颈癌患者术后标本获得)作为对照。

表1 卵巢癌病例基本信息[n(%)]

Table 1 The general information of patients with ovarian cancer[n(%)]

2.2免疫组织化学法检测正常卵巢和卵巢癌组织中垂体肿瘤转化基因和糖酵解代谢相关酶的表达

13例正常卵巢组织及68例卵巢癌病理组织进行免疫组织化学染色，结果显示，正常卵巢组织PTTG表达水平微弱，而在各种组织类型的卵巢癌组织中PTTG表达水平明显增加，见图1。根据浆液性卵巢癌按照组织细胞的分化程度的不同，分为高、中、低分化组，发现随着卵巢癌组织恶性分化程度的增加，PTTG表达水平也呈现出显著增加的现象，见图2。此外，参与肿瘤组织糖酵解代谢的相关酶LDHA、PKM2和GLUT-1的表达水平随着PTTG表达水平的增加呈现出逐渐增加现象，，并呈现出正相关关系(相关系数r=0.839～0.987区间，P<0.01)，见图2。

图1 不同组织类型的卵巢癌与正常卵巢组织PTTG表达水平(HE染色和免疫组织化学法)

Fig.1 PTTG expression levels of ovarian cancer tissues of different types and normal ovarian tissue (HE staining and immunohistochemical staining)

图2 不同分化程度的浆液性卵巢癌组织与正常卵巢组织PTTG、HK、PFK、LDHA、PKM2、GLUT-1表达水平差异(HE染色和免疫组化)

Fig.2 Differences in expression levels of PTTG, HK, PFK, LDHA, PKM2 and GLUT-1 between serous ovarian cancer tissues of different differentiated degree and normal ovarian cancer tissue (HE staining and immunohistochemical staining)

2.3 Western blotting检测正常卵巢和卵巢癌组织中垂体肿瘤转化基因和糖酵解代谢相关酶的表达

Western blotting检测正常卵巢及卵巢癌组织PTTG、 LDHA、PKM2和GLUT-1的表达情况，结果与免疫组化结果相一致，即在正常的卵巢组织中PTTG表达微弱(灰度为0.705±0.13)，而在卵巢癌组织中呈现高表达(灰度为2.616±0.33，n=58)，并与卵巢癌组织的恶性分化呈正相关性(Pearson检验r=0.908，P=0.012)；LDHA、PKM2和GLUT-1的表达水平也随着PTTG表达水平的增加，呈现出逐渐增加的表达水平，见图3A。

2.4 Western blotting检测4株常用卵巢癌细胞的垂体肿瘤转化基因表达差异

Western blotting检测4株常用卵巢癌细胞(A2780、SKOV-3、HO-8910和OVCA433)的PTTG表达水平，结果显示，4株胰腺癌细胞中均存在PTTG的表达，其中HO-8910、SKOV-3的PTTG表达水平显著高于A2780、OVCA433，进一步检测参与细胞糖酵解的相关酶的表达水平的变化，发现低分化的SKOV-3、HO-8910细胞HK、PFK、LDHA、PKM2和GLUT-1的表达水平也高于高分化的A2780、OVCA433细胞，见图3B。

图3A 不同分化程度的浆液性卵巢癌组织与正常卵巢组织PTTG、HK、PFK、LDHA、PKM2、GLUT-1表达水平差异(Western blotting)

Fig.3 A Differences in expression levels of PTTG, HK, PFK, LDHA, PKM2 and GLUT-1 between serous ovarian cancer tissues of different differentiated degree and normal ovarian cancer tissue (Western blotting)

图3B 4株卵巢癌细胞PTTG、PKM2、LDHA、GLUT-1在组织、细 胞表达水平差异

Fig.3B Differences in protein expression levels in PTTG, PKM2, LDHA and GLUT-1 in 4 strains of ovarian cancer cells

2.5下调垂体肿瘤转化基因对卵巢癌细胞A2780/SKOV-3增殖的影响

前期研究发现，PTTG的表达水平随着卵巢癌组织、细胞分化的恶性程度的增加而相应的增高，呈现出正相关关系。故推测通过下调PTTG的表达水平可以抑制卵巢癌细胞的快速增殖。成功构建慢病毒干扰载体PTTG-shRNA1和PTTG-shRNA2下调卵巢癌细胞株A2780/SKOV-3 PTTG的表达水平，见图4：A. qRT-PCR mRNA水平证实PTTG-shRNA2较PTTG-shRNA1更有效沉默PTTG；B. Western blot验证PTTG-shRNA2较PTTG-shRNA1更有沉默PTTG蛋白表达。

图4 慢病毒载体下调癌基因PTTG的表达水平并筛选有效干扰载体

Fig.4 Knockdowning PTTG protein expression level by lentivirus vector and screening of most efficient interference vector

2.6下调垂体肿瘤转化基因的表达水平抑制卵巢癌细胞的增殖

通过MTT法分别于12、24、36、48、60、72小时检测A2780/SKOV-3 PTTG-shRNA两株稳定转染的细胞的增殖水平，以空载体转染A2780/SKOV-3 EV-shRNA的细胞为对照，结果显示，慢病毒干扰载体沉默PTTG后，卵巢癌细胞的增殖能力显著受到抑制，有氧糖酵解相关酶的表达水平也显著下降(干扰前后灰度2.212±0.36 vs 0.782±0.18，P<0.01)，PTTG慢病毒干扰载体可显著抑制A2780/SKOV-3的增殖；进一步采用软琼脂糖克隆形成实验检测了A2780/SKOV-3的克隆形成能力，结果显示PTTG慢病毒干扰载体可显著抑制A2780/SKOV-3 的克隆形成能力；说明PTTG癌基因在卵巢癌细胞的增殖过程中具有重要作用,见图5。

注：A. PTTG-shRNA抑制卵巢癌细胞增殖；B. PTTG-shRNA抑制卵巢癌细胞克隆形成；C. PTTG-shRNA阻断卵巢癌细胞对EGF刺激的增殖效应。

图5 PTTG-shRNA对卵巢癌细胞增殖的影响

Fig.5 The impact of PTTG-shRNA on proliferation of ovarian cancer cells

2.7 PTTG-shRNA降低A2780/SKOV-3有氧糖酵解关键酶的表达水平

糖酵解代谢调节的研究发现，限速酶在该过程中具有至关重要的调节作用，决定着代谢流的方向和反应速度，在肿瘤细胞糖酵解反应中具有关键性的调节作用。本课题就此问题进一步检测了PTTG沉默后参与糖酵解代谢的调节的相关酶的表达水平变化，发现A2780/SKOV-3 PTTG-shRNA较A2780/SKOV-3 EV-shRNA 糖酵解代谢相关调节酶HK、PFK、PKM2、LDHA和GLUT-1表达水平均显著下降，见图6。

图6 PTTG下调对糖酵解代谢相关调节酶表达水平的影响

Fig.6 The effect of knockdowning PTTG on related enzymes of glycolysis

3讨论

3.1肿瘤细胞的Warburg效应

几乎所有肿瘤细胞均表现出快速增殖的生物特性，也是肿瘤组织得以长期存在、发生侵袭转移以及肿瘤治疗耐药的主要原因之一，但对于细胞快速增殖的原因目前仍然不清楚[10-12]。近年来，随着对肿瘤细胞代谢研究的深入，发现肿瘤细胞本质上具有不同于正常细胞的代谢表型，即Warburg效应，肿瘤细胞即使在氧气充足的环境中仍然以有氧糖酵解为主要的代谢供能方式，这种改变的代谢表型以满足转化细胞和肿瘤细胞的快速增殖的基础物质需求，为满足癌细胞合成的要求，癌细胞的代谢调节也发生了响应的变化[13-15]。

目前对于原癌基因PTTG在肿瘤发生发展中的作用研究较多，并且已经作为几种恶性肿瘤的分子标记，包括肝癌、肺癌、垂体肿瘤等[16]，但该基因在卵巢癌细胞代谢转变方面的分子机制研究较少。Wang 等[17]研究发现PTTG通过c-myc通路调节卵巢癌细胞的代谢转变，并且促使卵巢癌细胞的代谢流转向分化细胞特有的线粒体氧化代谢转变，研究认为PTTG有望成为卵巢癌代谢调节的生物靶点。

3.2 垂体肿瘤转化基因通过抑制有氧糖酵解代谢而抑制卵巢癌细胞的快速增殖

研究结果显示，在各种类型的卵巢癌组织中PTTG表达水平显著增加；随着卵巢癌细胞分化程度的恶化，PTTG的表达水平也显著增加，参与糖酵解的相关酶表达水平也随之增加。细胞水平研究发现，在低分化卵巢癌细胞PTTG表达增加，糖酵解相关酶HK、PFK、LDHA、PKM2以及GLUT-1表达水平显著高于高分化的卵巢癌细胞。下调PTTG基因后，发现卵巢癌细胞的增殖显著受到抑制，同时发现癌细胞的克隆形成能力也显著抑制，说明下调癌基因PTTG可以抑制卵巢癌细胞的增殖。为了探讨PTTG的作用机制，进一步检测了PTTG下调后卵巢癌细胞的有氧糖酵解相关酶，结果显示HK、PFK、LDHA、PKM2和GLUT-1表达水平也显著下降。以上结果说明PTTG可能通过降低有氧糖酵解反应过程中的相关调节酶的表达水平，而实现其抑制有氧糖酵解代谢的作用，从而抑制卵巢癌细胞的快速增殖。

根据本课题的研究工作，推测，通过沉默原癌基因PTTG，使PTTG蛋白表达下降，抑制有氧糖酵解代谢的多种酶，使丙酮酸进入线粒体的三羧酸循环，促进细胞的氧化磷酸化代谢，转变肿瘤细胞的代谢表型，抑制肿瘤细胞的快速增殖。本研究对原癌基因PTTG对卵巢癌细胞增殖代谢的研究，将为卵巢癌的代谢转变调节提供一定的基础研究依据，进一步为PTTG有望作为卵巢癌的分子靶向治疗提供一定的依据。

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[专业责任编辑：杨筱凤]

Knockdowning PTTG to inhibit proliferation of ovarian carcinoma cells via downregulating correlative enzymes of aerobic glycolysis

WANG Xiu1, YANG Ai-jun1, CAI Feng-mei1, WANG Hai-yan2, FENG Yan1

(1.Department of Gynecology and Obstetrics of Xi’an Fourth Hospital, Shaanxi Xi’an 710004, China;2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To explore effect of pituitary tumor transforming gene (PTTG) on ovarian cancer cells proliferation and its mechanism. Methods From 2010 to 2013 totally 68 pathological samples were collected from cases of ovarian carcinoma with complete clinical data in Xi'an Fourth Hospital.Relationship between PTTG and aerobic glycolytic correlative enzymes protein including hexokinase (HK), phosphofructokinase (PFK), pyruvate phosphokinase 2 (PKM2), lactate dehydrogenase (LDHA) and Glucose transporter 1(GLUT-1) was detected by immunohistochemistry and Western blotting from the aspects of tissue and cell. Stable PTTG silenced cell lines were established by downregulating PTTG with lentivirus interference vector. Cellular proliferating ability was detected by MTT and soft agarose clone trial. Protein expression levels of correlative enzymes involving in aerobic glycolysis after PTTG knockdown and glucose transporter (GLUT) were detected with Western blotting, and the mechanism was explored. Results PTTG expression levels showed positive correlation with enzymes involving in aerobic glycolysis including HK, PFK, PKM2, LDHA and GLUT-1 on ovarian cancerous tissue and cell levels (rvalue ranged from 0.839 to 0.987,P<0.01). The proliferating ability of ovarian cancer cells were inhibited correspondingly when suppressing PTTG by lentivirus interference vector, and the protein levels of correlative enzymes involving in aerobic glycolysis reduced significantly (gray level before and after interference was 2.212±0.36 and 0.782±0.18, respectively,t=2.36,P<0.01). The expression levels of PTTG, LDHA, PKM2 and GLUT-1 assayed by Western blotting were similar to immunohistochemistry results between normal tissue and ovarian cancer tissue. PTTG protein level showed subtle expression (gray level was 0.705±0.13，n=13)but high expression level in ovarian cancer tissue (gray level was 2.616±0.33，n=58)，and it presented positive correlation with malignant differentiation(r=0.908，P=0.012). Conclusion PTTG could inhibit metabolism of acrobic glycolysis and thus inhibit rapid proliferation ovarian cancer cells probably through downregualting protein expression levels of correlative enzymes involving in aerobic glycolysis.

ovarian cancer; pituitary tumor transforming gene (PTTG); aerobic glycolysis; cellular proliferation

2016-09-09

王 秀(1975-)，女，副主任医师，主要从事妇科肿瘤研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.11.017

R711.75

A

1673-5293(2016)11-1343-05