聚合酶链反应在猫几种病毒诊断中的应用

(吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118)

聚合酶链反应在猫几种病毒诊断中的应用

杜翔宇，孙英尧，杨一鸣，董浩

(吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118)

本文以聚合酶链反应检测技术的理论与应用为基础，立足于猫细小病毒、猫杯状病毒及猫疱疹病毒的生物学特征，对聚合酶链反应检测猫几种病毒的应用现状进行综述，为实验用猫的检测以及实验用猫的标准化奠定了基础，同时在公共卫生学方面也具有重要意义。

1 聚合酶链反应在猫细小病毒病诊断中的应用

1．1 猫细小病毒生物学特征猫细小病毒(Feline parvovirus virus，FPV)具有高度接触传染性，以引起猫科动物以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为主要临床特征的病毒性传染病，故又称之为猫传染性肠炎病毒、猫泛白细胞减少症病毒和猫瘟病毒;病毒核酸为二十面体对称的单股、无囊膜的DNA病毒，直径为20～24 nm;FPV除了感染猫科动物外，还感染浣熊、水貂和狐狸等动物，该病对各种野生动物造成极大的威胁，具有很高的发病率和死亡率。目前，FPV在细小病毒属中属于感染范围最广、致病性最强的一种病毒［1］。

1．2 猫细小病毒病病毒的诊断猫细小病毒广泛存在于世界各地，是发病率和死亡率高的一种病毒性传染病，PCR作为灵敏度高、准确的一种检测方法在FPV诊断中具有重要的价值。李爽建立了具有高度特异性和灵敏性的FPV PCR检测方法，对长春地区某宠物医院的疑似FPV感染猫进行检测，结果为FPV阳性［2］。王翀根据GenBank中FPV NS基因、FCV ORF2基因、FHV-I TK基因设计3对引物，猫细小病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒可在同一PCR体系中扩增出来，最低检出限分别为101．5TCID50、101．9TCID50、101．2TCID50，血清检测结果表明，阳性率分别为5%、2．5%、4．1%，该方法具有良好的特异性和敏感性［3］。王吉建立FPV的PCR检测方法，研究结果表明，与猫疱疹病毒I型、猫冠状病毒、猫合胞体病毒、猫免疫缺陷病毒均无交叉反应，检测病毒最小滴度为5 lg TCID50/mL，DNA模板浓度为4．9×102拷贝/μL，在猫临床样本33份中检测出21份FPV阳性［4］。邱杰建立了FPV PCR快速检测方法，检出的最小DNA浓度为6．19×10－8μg/μL ，检出DNA浓度低于1fg/μL，灵敏度高、特异性高，在3004份样品中检出13份FPV核酸阳性，可应用于FPV流行病学调查［5］。猫细小病毒还可以感染猫科动物，乔军应用PCR技术对1只病死东北虎的脾脏进行检测，得到与标准FPV完全一致的核酸条带，而对轮状病毒、犬腺病毒、犬瘟热的检测均为阴性，PCR技术的特异性与灵敏性远远高于常规的血凝和血凝抑制试验［6］，为虎、熊猫和狮子等动物的早期诊断以及进出口部门检疫工作提供了技术支持。

2 聚合酶链反应在猫杯状病毒诊断中的应用

2．1 猫杯状病毒生物学特征猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)是杯状病毒科、水疱性病毒属的成员之一［7］;能够引起猫科动物急性口腔溃疡、结膜炎、急性关节炎、上呼吸道传染病和慢性胃肠炎等疾病，故又叫猫传染性鼻-结膜炎;病毒是无囊膜的单股正链RNA，直径为30～40 nm;FCV在猫科动物中广泛流行，是危害猫科动物的重要病原之一，在我国猫群、虎和猎豹之间也存在感染FCV流行的报道［8］。FCV可导致动物患血热样疾病，FCV的变异也可导致VSD的暴发，引起人们高度重视。

2．2 猫杯状病毒的诊断猫杯状病毒呈世界性分布，接种疫苗的动物仍然可以成为持续性感染源，造成疾病的流行。该病的鉴定方法有病毒分离鉴定和血清学试验等多种方法，然而PCR方法具有敏感性高、特异性强、操作简易等优点，对有效控制FCV的传播提供了有效的方法。郑翠玲应用RT-PCR和重组PCR技术扩增了FCV CH-GD株的全基因，用DNAStar软件比较分析其氨基酸序列和核苷酸序列，采用重组PCR方法获得了含突变位点的FCV全长cDNA克隆［9］。刘晔设计一对FCV衣壳蛋白基因正反向引物，该病毒为自然弱毒株，并进行了免疫幼猫的试验，产生较高水平的中和抗体，能抵抗FCV强毒株攻击而不发病［10］。Mohamed等建立了检测FCV的实时荧光定量PCR法，并用此法和病毒分离法对122个样本进行了检测，该法和病毒分离法都具有较高的灵敏度与特异性，但是该检测方法用时更短［11］。姜雪建立了检测FCV的荧光定量PCR方法，只能检出FCV而其他猫相关病毒为阴性，线性范围为2．264×1011－2．264×101拷贝/μL，重复性试验变异系数为2．158%，对24份疑似FCV猫唾液检测，结果与病毒分离鉴定一致［12］。Chris等建立了SYBR greenI实时荧光定量PCR方法，并且对FCV分离株进行了检测，反应结束后，根据熔解曲线和熔解温度可区分出不同FCV分离株，其特异性强、敏感度高，可精确定量病毒模板的浓度［13］，具有潜在的应用价值。

3 聚合酶链反应在猫疱疹病毒诊断中的应用

3．1 猫疱疹病毒生物学特征猫疱疹病毒(Feline herpesvirus，FHV)属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科的成员，病毒核酸为有囊膜、双链DNA，直径为128～168 nm;可引起的猫的急性和高度接触性的上呼吸道感染［14］;病原的组织嗜性广，不仅侵害呼吸系统，还侵害神经系统、生殖系统、胚胎等。病毒在患病猫的舌、鼻、结膜、咽喉、气管、支气管等部位增殖，发病率可达到100%，死亡率可达到50%;目前国内没有专门的猫疱疹病毒等猫易感病毒临床检测的机构，对于实验用猫未见有开展FHV-Ⅰ检测的报道;FHV-Ⅰ感染所致疾病与猫杯状病毒、猫细小病毒引起呼吸道感染和猫肺炎在临床上很难区分［15-16］，需利用实验室方法进行鉴别诊断。

3．2 猫疱疹病毒的诊断猫疱疹病毒I型的检测主要是采用病毒的分离鉴定、组织学检查、免疫荧光等方法［17］，国外已有人建立了针对FHV-1的PCR检测技术［18-19］，国内数人也都建立了PCR检测方法。刘宝山建立FHV-Ⅰ型PCR方法，扩增序列与GenBank上序列同源性达到100%，特异性高、灵敏度高，可以从103个拷贝的样品中检测出FHV-Ⅰ型，临床样品检测结果表明，与间接免疫荧光的阳性符合率可达95．8%［20］。林颖设计FHV-Ⅰ型gD基因的引物，建立了PCR诊断方法，可从含有103个拷贝的样品中检测出FHV-Ⅰ，灵敏性高;特异性强，仅能扩增出猫三联弱毒苗［21］。屈哲设计针对TK基因的引物，PCR产物与GenBank基因部分序列同源性达到100%，建立的PCR检测方法的敏感性试验能检测出的最低DNA量约为300 pg［22］。王吉建立的PCR方法灵敏性高，可检测FHV-Ⅰ最小滴度为7 lg TCID50/mL，相应的DNA模板浓度为1．46×102拷贝/mL，在15份猫临床样本中检出10份FHV-Ⅰ阳性，适合于临床对该病的感染检测［23］。李林翔建立虎源FHV-Ⅰ巢式PCR的快速鉴定方法，可以特异扩增出FHV-Ⅰ的gD基因片段，检测极限是1×102copies/μL，敏感性明显高于一步法PCR，对疑似FHV-1的样品进行检测，结果与病毒分离鉴定一致［24］。实时荧光定量PCR技术不仅可以提高检测的特异性与准确性，还可以对病毒核酸进行定量分析。王吉建立的实时荧光定量PCR检测方法实现了对猫FHV-Ⅰ核酸的定量检测分析，线性范围1×102－1 ×109copies/μL。检测灵敏度可达到10copies/μL。批内变异系数均小于5%，且适合于临床FHV-Ⅰ的快速定量检测［25］。刘健建立的FHV-Ⅰ实时荧光定量PCR方法可特异地检测出FHV-Ⅰ的DNA，敏感性达到75 fu/μL，反应效率达到107%，R2值为0．9 965，Ct值的变异系数低于2%，应用该方法对上海地区宠物门诊送检的疑似FHV-Ⅰ感染的样品进行检测，其阳性率达到27．78%，高于普通PCR的15．87%［26］。

4 结语

随着分子生物学的不断发展，人们对猫细小病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒这3种病毒的认识越来越深刻，在基因组和分子生物学功能等方面取得较大进展，猫细小病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒作为猫的重要传染病原，严重威胁猫科动物的养殖，至今尚无特效药物和有效的治疗办法控制其发生和复发，在诊断和预防方面还需要进一步建立准确、简便、快速的方法;传统疫苗在病毒防制过程中起到重要的作用，大多数尚处于实验研究阶段，免疫原性差，迫切地需要制备高效、稳定、无毒副作用的新型疫苗，因此研制开发新型、安全、高效的疫苗具有很好的应用前景。

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S852．65+9．2

A

0529-6005(2017)01-0072-03

2016-08-15

吉林省教育厅科学技术研究项目(2015209)

杜翔宇(1989-)，硕士生，从事分子病原微生物与分子免疫学研究，E-mail:dxy1209@163．com

董浩，E-mail:donghao_jlau@163．com