黄芩苷对原代大鼠肝细胞CYP3A1的影响

贾敬亮，陈有旺，张鹏程

(1．衡水市畜牧技术推广站，河北 衡水 053000;2．廊坊职业技术学院动物科学与技术系，河北 廊坊 065000)

黄芩苷对原代大鼠肝细胞CYP3A1的影响

贾敬亮1，陈有旺2，张鹏程1

(1．衡水市畜牧技术推广站，河北 衡水 053000;2．廊坊职业技术学院动物科学与技术系，河北 廊坊 065000)

胶原酶二步灌流法获取原代大鼠肝细胞，用不同浓度的黄芩苷处理1～3 d，Western Blot法检测细胞色素P450 3A1(CYP3A1)的表达。结果表明，通过胶原酶灌流法，每只大鼠可获得2－4×108个肝细胞，存活率约为95%。低浓度(＜10μmol/L)的黄芩苷处理后，肝细胞CYP3A1的表达随黄芩苷浓度的增加和处理时间的延长而呈升高的趋势。高浓度(＞10μmol/L)黄芩苷对细胞产生毒性，原代大鼠肝细胞可用于黄芩苷药物代谢的研究，为探讨其他药物的代谢打下了基础。

黄芩苷;大鼠;原代肝细胞;CYP3A1

黄芩苷是传统中药黄芩的主要药效成分，具有抗菌、抗氧化、清除自由基、抗炎、抗过敏、保护心血管、抗肿瘤、对脑损伤的修复保护、对糖尿病肾病的改善等药理作用［1－2］，并对多种因素引起的肝脏损伤具用明显的保护作用［3－5］。细胞色素P450 3A家族(CYP3A)是动物体内重要的Ⅰ相代谢酶，占肝脏中细胞色素P450酶(CYP)总量的25%～28%，约有60%的临床药物经肝脏CYP3A代谢［6］，在内源性和外源性物质的代谢中起着极其重要的作用。CYP3A1是大鼠CYP3A亚族最主要的亚型，它的活性高低直接影响许多药物的治疗效果和毒性反应。目前，黄芩苷对肝细胞CYP3A1有无诱导作用尚不清楚。

体外培养的原代大鼠肝细胞具有较好的体外试验重现性，基本维持了肝脏的代谢功能，并能很好地保留与体内一致的CYP水平。本试验采用胶原酶两步灌流法分离大鼠肝细胞，并用黄芩苷作用肝细胞，通过测定其CYP3A1的表达，在细胞及分子水平上探讨了黄芩苷药物代谢的机理，为黄芩苷的临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 成年SD雄性大鼠(清洁级)，体重(100～150)g，购自河北省实验动物中心。

1.2 主要试剂 黄芩苷，购自中国药品生物制品检定所，William's E培养基(WME)、Hank's液、胶原酶Ⅰ、PCN(Pregnenolone-16α-Carbonitrile)，购自Sigma公司;胎牛血清，购自北京元亨圣马生物技术研究所;Bradford蛋白定量试剂盒、预染蛋白 MarkerⅢ，购自北京天根生化科技有限公司;兔抗大鼠CYP3A1抗体，购自Chemicon公司;碱磷酶标记山羊抗兔IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司; NBT、BCIP，购自Amresco公司。

1.3 肝细胞的分离和培养 胶原酶二步灌流法分离原代大鼠肝细胞，大鼠用速眠新麻醉后，打开腹腔，门静脉插管，先灌入含0.5 mmol/L EGTA的无钙Hank's液，漂洗大鼠肝脏2 min，再用0.04%胶原酶Ⅰ消化5 min，最后用Hank's液漂洗2 min后取出肝脏，分离肝细胞，肝细胞用WME培养基洗涤3次，1 000 r/min离心5 min，获得纯化的肝细胞悬液。将所得肝细胞悬液用0.4%的台盼蓝染色，检测细胞活力并计数，用贴壁培养基调整细胞密度至3× 105cells/mL。接种于大鼠尾胶原处理的12孔板中，3×105/孔，37℃、5%CO2条件下，在WME中培养。24 h换液1次，并观察肝细胞形态。

1.4 黄芩苷处理肝细胞 0.01～100μmol/L黄芩苷处理肝细胞1～3 d，10μmol/L PCN为阳性对照，蛋白裂解液收集蛋白，Bradford蛋白质定量试剂盒检测蛋白浓度。

1.5 Western Blot法检测CYP3A1的表达 蛋白变性，12%SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶封闭，加TBST 1∶4 000稀释的CYP3A1一抗，TBST洗膜，加TBST 1∶2 000稀释的碱磷酶标记IgG二抗，TBST洗膜，NBT/BCIP显色，用ImageJ软件计算所得条带的灰度值。

2 结果

2.1 肝细胞的获取 每只大鼠可获得2～4×108个肝细胞，存活率在95%左右。

2.2 肝细胞的形态 倒置显微镜下观察，新鲜分离的肝细胞呈圆球状，单个散在;4 h后，大部分细胞贴壁生长并展开，连接成索状;24 h后，贴壁的肝细胞呈典型上皮细胞样的多角形形态，体积增大，细胞间开始出现岛屿状连接(见中插彩版图1);48 h后，肝细胞连接为成片岛屿状;72 h后，肝细胞形态特征更加典型，单层生长呈板状、条索状(见中插彩版图2)。

2.3 黄芩苷对CYP3A1表达的影响 黄芩苷作用24 h、48 h、72 h均对CYP3A1具有诱导作用。在作用24 h内，浓度低于0.5μmol/L的黄芩苷对肝细胞CYP3A1诱导作用不明显，浓度增大到1μmol/L后，CYP3A1的表达随药物浓度的增加呈上升趋势。作用48 h、72 h时，在黄芩苷浓度低于10μmol/L时，随药物浓度的增加和作用时间的延长，诱导作用增强，但浓度高于10μmol/L后，CYP3A1的表达明显减弱(见中插彩版图3)。

3 讨论

3.1 原代大鼠肝细胞的分离培养 原代肝细胞的分离方法有机械法、螯合法和酶消化法等。早期的机械法对细胞损伤严重，获取的肝细胞数量少，且功能活性低。螯合法是用能够结合Ca2+、Mg2+的螯合剂来分离肝细胞，但分离细胞效果差。目前应用最广泛的是胶原酶二步灌流法，因其在胶原酶消化细胞前使用了鳌合剂，对肝细胞损伤小，且分离彻底，是较好的肝细胞分离方法［7］。

本试验应用胶原酶二步灌流法成功地获得了活力强、形态完整的原代大鼠肝细胞。在分离过程中最关键的是胶原酶的用量和消化时间，胶原酶的浓度过高则作用时间难以控制，浓度过低则作用时间过长，细胞存活率低。在细胞培养中，选用合适的培养条件和培养基也非常重要。研究表明，正常肝细胞表面存在某些生长因子受体和激素受体，在培养液中加入合适的外源性生长因子和激素，共同发挥生物效应，对促进体外培养肝细胞的生长、分化、增殖及生物学功能的维持具有重要作用，不同类型的培养基对肝细胞的培养也有明显的影响［8］。本文先用含有 10%胎牛血清及 10 mg/L ITS、100 nmol/L地塞米松的WME培养基中培养，待肝细胞贴壁后，换用不加血清的WME培养基培养，结果表明，肝细胞生长良好，并可长期培养用于试验研究。

3.2 黄芩苷对肝细胞CYP3A1的影响 CYP是体内重要的药物代谢酶，临床和药理研究表明，中草药可对它产生诱导或抑制作用，从而引起自身和其他药物的药代动力学的变化，中药的浓度、用药时间、给药方式等多种药物因素均会影响其对CYP的作用［9］。黄芩苷是中药黄芩的主要药效成分，具有广泛的药理作用，且对肝脏损伤具有明显的保护作用，侯艳宁等［10］，报道黄芩苷可诱导 CYP1A1、CYP2B1及CYP2C11等3种同功酶，另有研究表明，黄芩苷对大鼠肝微粒体CYP450酶7种亚型均无抑制作用，而对人肝微粒体 CYP1A2，CYP2C19和CYP2E1有较弱的抑制作用［11］。为确定黄芩苷对肝细胞CYP3A1的影响，本研究利用不同浓度的黄芩苷作用原代培养的大鼠肝细胞，并利用Western Blot法检测了CYP3A1的表达。研究结果证实，黄芩苷对肝细胞CYP3A1确有诱导作用，且与药物浓度和作用时间均有关。在短时间内低浓度黄芩苷不能够诱导CYP3A1的表达，但随着作用时间的延长和药物浓度的增加，对CYP3A1的诱导作用会逐渐增强，而高浓度(＞10μmol/L)的黄芩苷随作用时间延长，会对细胞产生毒性，致使部分细胞死亡，10μmol/L的黄芩苷是作用大鼠肝细胞72 h内的最佳用药浓度。

［1］ 丁婵，褚秀玲，苏建青，等．黄芩苷抗病毒作用研究进展［J］．中兽医医药杂志，2016，35(2):27-29．

［2］ 黄志军．黄芩苷药理作用研究进展［J］．天津药学，2012，24 (3):61-64．

［3］ 章宝燕，林拥华，林志强．黄芩及其有效成分的肝脏保护作用研究进展［J］．中国中医药信息杂志，2014，21(12):129-133．

［4］ 高平章，陈金珍，李安娜，等．黄芩苷对对乙酰氨基酚诱导小鼠肝损伤中蛋白质氧化及硝化的影响［J］．华中科技大学学报，2015，44(1):64-68．

［5］ 刘嵩，吕晓慧，孙宗喜，等．黄芩苷抗氧化活性及对四氯化碳致大鼠肝损伤的保护作用［J］．中国药学(英文版)，2015，24 (8):538-544．

［6］ Krippendorff B F，Lienau P，Reichel A，et al．Optimizing classification of drug-drug interaction potential for CYP450 isoenzyme inhibition assays in early drug discovery［J］．Journal of Biomolecular Screening，2007，12(1):92-99．

［7］ 徐哲，白雪帆，滕光菊，等．大鼠肝细胞分离、原代培养及生物学特性研究［J］．医学研究生学报，2003，16(5):342-351．

［8］ Hamilton G A，Westmoreland C，George A E．Effects of medium composition on the morphology and function ofrathepatocytes cultured as spheroids and monolayers［J］．In Vitro Cellular Developmental Biology(Animal)，2001，37(10):656-667．

［9］ 王丹，张振清，阮金秀．中药对细胞色素P450诱导或抑制作用的影响因素［J］．解放军药学学报，2008，24(3):242-244．

［10］ 侯艳宁，朱秀媛，程桂芳．黄芩甙对小鼠肝细胞色素P450及其亚家族的诱导［J］．解放军药学学报，2000，16(2):68-71．

［11］ 黄凯，刘志浩，贺晴．黄芩苷对大鼠和人肝微粒体CYP450酶的抑制作用［J］．中国实验方剂学杂志，2016，22(3):20-23．

Effects of Baicalin on Cytochrome P450 3A1 in Rat Primary Cultured Hepatocytes

JIA Jing-liang1，CHEN You-wang2，ZHANG Peng-cheng1

(1．Hengshui Animal husbandry technology promotion station，Hengshui053000，China; 2．Animal Science and Technology Department，Langfang Polytechnic Institute，Langfang 065001，China)

Rat primary cultured hepatocytes were isolated by two-step collagenase digestion method and treated with gradient concentration of baicalin for 1－3 d，and the expression of cytochrome P450 3A1 was determined by Western Blot．The results showed that 2－4×108cells per rat were obtained and the viability was about95%．The expression of CYP3A1 in rat hepatocytes increased gradually with the treatment of low concentration baicalin(＜10 mol/L)，and high concentration(＞10 mol/L)baicalin injured hepatocytes．Rat primary cultured hepatocytes can be used for investigation of baicalin metabolism，and it also makes a foundation to explore other drugs metabolism．

baicalin;rat;primary cultured hepatocyte;CYP3A1

S853．7

A

0529-6005(2017)06-0037-02

2016-07-07

贾敬亮(1981-)，男，兽医师，硕士，从事畜牧兽医工作，E-mail:jiajingliang1981@163．com