微生物发酵生产纤维素乙醇的研究

南怀燕，孙尚琛，胡 巍，李文新，王永刚，刘晓风，冷非凡

（1.兰州兰石能源装备工程研究院有限公司，甘肃 兰州 730314；2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

微生物发酵生产纤维素乙醇的研究

南怀燕1，孙尚琛1，胡 巍1，李文新1，王永刚2，刘晓风2，冷非凡2

（1.兰州兰石能源装备工程研究院有限公司，甘肃 兰州 730314；2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

目前，随着全球非可再生资源的不断消耗及因此引起的环境问题和公众卫生问题，清洁、高效、环保型的新兴能源已成为诸多领域的研究热点。基于生物乙醇的可持续性与环保性，通过微生物发酵的方法生产纤维素乙醇已成国内外研究热点。该综述归纳了可发酵纤维素生产乙醇的微生物种类及其代谢途径，以期为纤维素乙醇的发酵生产提供菌种支撑，为我国可再生能源的发掘提供理论基础。

微生物；木质纤维素；嗜温耐热菌；燃料乙醇；发酵

由于全球能源消耗量的不断上升，低成本化石燃料的损耗和气候的不断恶化，研究开发可再生能源和环境友好型能源是解决以上问题的必经之路[1][2]。目前，以技术性、经济性、环境性、稳定性为原则已提出许多潜在的可替换燃料，如：生物乙醇，生物丁醇，生物柴油，甲醇，氢，压缩天然气（CNG），生物沼气和太阳能燃料等[3]。

在诸多替代燃料中，生物乙醇被证明是最有潜力的化石燃料替代物。其不仅可减少温室气体、致癌物质的排放，还可以缩减一部分生产成本[4,5]。

微生物产酶发酵纤维素是生产生物乙醇的一条重要途径[6]。嗜温耐热微生物因具有较好的耐酸和耐盐性，使其能更高效率地利用木质纤维素生物质（LCB）[7,8]。本文就可产酶催化生产乙醇的微生物种类及其代谢途径展开论述，以期为纤维素乙醇的大规模工业生产提供一定的技术与理论参考。

1 、产乙醇微生物

在发酵工业中，污染是造成乙醇产量低和抑制化合物生成的主要原因，而低pH、高温度和耐酒精是解决污染问题的有效途径[9]。嗜温微生物作为发酵工艺的推动者因其能在较高温度下保持高活性的生长状态及能发酵各种纤维素生物质原料产生化学品燃料成为生物乙醇研究领域的热点。其中嗜中温菌或单一嗜热中温菌的最适生长温度为50-64℃，极端嗜热菌的最适生长温度为65-79℃，超嗜热菌的最适生长温度高于80℃[10]。以下是几种耐热和嗜热产乙醇菌。

1.1 梭菌属

梭菌属是最早被发现的产乙醇菌，属于梭菌科家族（Clostridiace）。Ng等[11]研究梭菌属热纤维LQRI和热硫化氢39E在以一些纤维（如MN300纤维素、微晶纤维素、滤渣、二氧化硫处理的木材和蒸汽爆裂木材纤维）为底物共培养发酵时发现MN300纤维素的最高乙醇产量为0.46g/g。热纤维梭菌SS19在最适培养基（滤纸45g/L，玉米浆8g/L，半胱氨酸氯化物0.25g/L，硫酸亚铁0.01g/L）条件下的乙醇产量为0.41g/g[12]。

1.2 杆菌属

热解糖杆菌，之前被称为热解糖热厌氧杆菌，属于厚壁菌门的嗜热杆菌。热解糖梭菌JW/SL-YS485在温度45-65℃和pH4.0-6.5下，能直接发酵半纤维素和木聚糖聚合物，以及纤维生物质中的主要糖类（纤维二糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖）[13]。Sveinsdottir等发现用热厌氧杆菌 AK17发酵纤维素、草和木屑时的乙醇产量分别为1.20、0.98和0.15g/L。Sigurbjornsdottir和Orlygss-on[14]从冰岛的热泉中分离出能生产乙醇的杆菌属嗜热微生物AK54 。

1.3 高温厌氧杆菌属

高温厌氧杆菌属属于厚壁菌门，胞内含有醇脱氢酶和木糖转运蛋白，参与维生素B12的生物合成途径，还可以改变戊糖代谢途径，是已报到的在发酵领域最有应用前景的微生物[15]。Georgieva和Ahring[16]发现在70℃的一个连续固定化反应器中用热厌氧杆菌BG1L1发酵玉米浆产生乙醇的产量为0.39-0.42g/g。

有研究发现通过微生物共培养能提高乙醇的产量。己糖发酵中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和戊糖发酵中的戊糖球菌（T.pentosaceus）通过共培养的方式发酵油菜秸秆，最终的乙醇量是理论值的85%，分别比酵母和细菌单独培养发酵高出14%和50%[17]。

1.4 酿酒酵母菌属

酿酒酵母具有安全性好、高产量和高的抑制剂耐受性等优点，在纤维素生物乙醇的生产中具有重要作用[18]。

1.4.1 克鲁维酵母属

克鲁维酵母菌是酵母科的子囊菌类酵母属。此类菌种最主要的特性是在高温下可广泛地利用糖基质（阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、木糖）来生产乙醇[19]。Kumar等[20]报道了克鲁维酵母菌IIPE453在以葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、蔗糖等为底物的发酵活性进研究结果。结果表明在温度，pH和最初葡萄糖浓度分别为50℃，5.0和10gL-1时，甘蔗渣水解液与甘蔗汁，糖蜜和提取物混合物的产乙醇量分别为1.7、1.75和2.57gL-1h-1。乙醇发酵中除了葡萄糖的耐受性达到300gL-1之外，pH和温度都是相同的[21]。

1.4.2 毕赤酵母属

毕赤酵母（Pichia）是含有球形，椭圆和长方形细胞形态的酵母科中的酵母属。这些菌种大多用于戊糖的发酵。Kwon等[22]用毕赤酵母IPE100在42℃下发酵葡萄糖和玉米秆的产乙醇量分别是理论值的85%和93.8%。通过生物学的方法对毕赤酵母进行基因改造是增加乙醇的产量重要途径。Kitagawa等[23]构建了毕赤酵母的转化系统以表达棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）BGL基因，100gL-1含有外源基因的转化菌株在40℃下发酵72h生产的乙醇量为29gL-1。

2 、代谢途径

嗜热微生物能利用许多从LCB到生物能源转化的糖类。利用底物的范围取决于最适生长温度和群落生境。极端嗜热水生古菌（Topt≥80℃）能利用α-和β-葡聚糖，如淀粉、大麦葡聚糖、海带多糖和几丁质，而极端嗜热水生细菌（Topt≥80℃）同样能利用葡聚糖、半纤维素（木聚糖和甘露聚糖）。然而，这些微生物都不能有效利用结晶纤维素[24]。

所有已发现的分解糖的嗜热微生物按EMP途径代谢葡萄糖[25]。其他的己糖如半乳糖和甘露糖在嗜热菌的存在下通过几种降解酶直接到EMP途径。戊糖（木糖或阿拉伯糖）通过PPP代谢产生3-P-甘油醛，接着到EMP代谢途径[9,26]。

在微生物利用天然木糖和阿拉伯糖的过程中，细菌利用异构酶途径形成中心代谢中的戊糖，而酵母和丝状真菌主要利用还原酶/脱氢酶途径[27]。细菌通常用酶XI将D-木糖转化为D-木酮糖，而酵母和真菌首先通过酶XR将D-木糖还原为木糖醇，之后通过酶XDH氧化为木酮糖，进一步氧化形成D-木酮糖-5-磷酸[28]。

许多进行氧化戊糖磷酸途径的酵母和嗜热菌形成的NADPH和核糖-5-磷酸用于还原生物合成[29]。然而，在嗜热产乙醇菌中，像木糖和阿拉伯糖通过非氧化戊糖磷酸代谢途径，木酮糖-5-磷酸异构为核酮糖-5-磷酸，之后核酮糖-5-磷酸通过NADPH铁氧化还原酶形成核糖-5-磷酸。戊糖磷酸途径中的产物以果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸的形式用于EMP途径。果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸在厌氧条件下通过丙酮酸盐转化为不同的终发酵产物[25]。

木质纤维素的水解产物发酵产乙醇需要微生物，该微生物在抑制剂如弱酸、糠醛和酚醛塑料存在下能发酵己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）和戊糖（木糖和阿拉伯糖）[30]。Hahn-Hagerdal等[31]研究发现酿酒酵母是发酵乙醇产品的优选微生物，对代谢抑制物具有抵抗性。

丙酮酸盐是糖类代谢中的中间代谢物，先形成乙醛最终形成乙醇。耐热微生物中通过pdc编码的PDC是一种TPP酶，能将丙酮酸盐转化为乙醛。在超级嗜热菌中PDC活性具有双重功能，一种是来自超级嗜热古菌火球菌的依赖TPP和CoA的PFOR/PDC酶。另一种是与丙酮酸盐催化生成乙醛有关的酶，是乙酰CoA ALDH(mhpF和adhE基因编码)。嗜热菌（Geo-bacillus 和Thermoanaeroba-cter）中丙酮酸盐通过PFOR 或者PFL氧化为乙酰-CoA，ALDH催化乙酰CoA还原为乙醛。最后，乙醛通过ADH还原为乙醇[27]。另外， 也发现了几种嗜热菌在细胞中不同生理功能中的多重ADHs[32]，且通过渗透单元获得了17%的乙醇。许多研究者已发现了增加膜通量的膜基质材料。Le和Wang[33]发现了新的混合基质膜Pebax/POSS通过渗透分离回收乙醇。Zhan等[34]研究沸石和沸石中Si/Al的比例对乙醇-水混合物渗透功能的影响。随着沸石从10%到30%的增加，在50℃含有5%乙醇的混合液中，总渗透量从265gm-2h-1显著增加至820.7gm-2h-1，而分离因子从11.3增加到13.7。含30%沸石的沸石填充复合膜在一定的乙醇浓度（5-90%）范围内时乙醇具有选择透过性，尤其是在低浓度乙醇范围内表现出了优越的渗透性能。

3 、展望

LCB为生物燃料的研究与生产提供了潜在的原材料，特别是有助于清洁环境和碳中期循环的生物乙醇。然而，这个过程在遗传工程方法中具有不同的技术差距，在发酵工程中，通过高通量技术和共发酵酶复合体的高效表达来提高菌株的活性。也可利用功能基因组学和代谢工程学相结合的方法筛选优良菌株。此外，可以用流量分析的方法改变关键酶的活性以增加木糖的利用。而且，对LCB原料或是相关酶理化性质的研究也能提高乙醇的产量和生产率。相信随着生物技术及各领域的协同发展，以微生物为手段的LCB原材料利用将是能源开发的趋势，也是解决能源危机、改善环境质量的必经之路。

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Microbes for production of lignocellulosic ethanol

Nan Huaiyan1 Sun Shangchen1 Hu Wei1 Li Wenxin1 WANG Yonggang2 Liu Xiaofeng 2 Leng Feifan2

（1.Lanzhou Lan Shi equipment engineering research institute co., LTD, Lanzhou, Gansu730314, China; 2.School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou,Gansu 730050 China）

With the world of renewable resources consumption，it is caused by serious environmental and public health problems，thus clean，efficient and environmentally friendly new energy has become a hot research topic in many fields.Based on the sustainability and environmental protection of bioethanol，cellulosic ethanol production by microorganism fermentation has become a key research focus at home and abroad.This review summarizes microbe types and its metabolic pathway of the fermentable cellulose ethanol，in order to provide strains for cellulosic ethanol fermentation production and theoretical basis for China's renewable energy.

Microorganism; Lignocellulose; Thermophiles; Fuel ethanol; Fermentation。