利拉鲁肽通过microRNA-33对2型糖尿病小鼠肝损伤的治疗作用

郜 娜， 杨庆宇, 刘秀梅

(1郑州大学附属肿瘤医院, 河南省肿瘤医院药学部， 2郑州人民医院药学部，河南 郑州 450000)



利拉鲁肽通过microRNA-33对2型糖尿病小鼠肝损伤的治疗作用

郜 娜1△， 杨庆宇2, 刘秀梅2

(1郑州大学附属肿瘤医院, 河南省肿瘤医院药学部，2郑州人民医院药学部，河南 郑州 450000)

目的： 观察利拉鲁肽对2型糖尿病小鼠肝组织微小RNA-33(microRNA-33,miR-33)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及肝细胞凋亡通路相关蛋白的影响，探讨其可能作用机制，为临床应用提供药效学依据。方法： 采用高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射复制C57BL/6小鼠2型糖尿病模型。小鼠随机分为4组，每组15只：对照组为正常小鼠皮下注射等量的生理盐水；模型组为T2DM小鼠皮下注射等量的生理盐水；利拉鲁肽低剂量组为T2DM小鼠皮下注射100 μg·kg-1·d-1利拉鲁肽；利拉鲁肽高剂量组为T2DM小鼠皮下注射200 μg·kg-1·d-1利拉鲁肽。给药4周后进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，检测各组小鼠空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量；HE染色检测肝组织病理学变化；免疫荧光检测肝组织的cleaved caspase-3；Western blot法检测p-AMPK/AMPK及凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3的水平；实时定量PCR检测肝组织miR-33的水平。结果： 与模型组相比，利拉鲁肽高、低剂量组小鼠FBG、TG、TC、LDL-C、ALT及AST含量明显降低，HDL-C含量明显升高(P<0.05)；肝组织病理结构的紊乱得到明显改善；免疫荧光结果可见，利拉鲁肽高、低剂量给药组小鼠的cleaved caspase-3明显降低；Western blot实验结果可见，利拉鲁肽高、低剂量给药组小鼠肝组织的Bcl-2表达明显增高，caspase-3表达显著下降(P<0.05)，肝组织AMPK磷酸化水平显著增加(P<0.01)；且肝组织miR-33水平显著降低(P<0.01)，且呈一定的剂量依赖性。结论： 利拉鲁肽可以缓解2型糖尿病小鼠肝损伤，其机制可能与降低肝组织miR-33表达，从而增加AMPK磷酸化水平，进而抑制肝细胞凋亡有关。

利拉鲁肽; 微小RNA-33; 腺苷酸活化蛋白激酶; 肝细胞凋亡

糖尿病肝损伤是继发于糖尿病，以肝功能损害为特点的慢性并发症，表现为肝脏组织学和功能变化的改变。糖尿病导致脂质代谢紊乱，肝内脂肪酸增多，脂肪在肝细胞中堆积形成脂肪肝，甚至演变为肝硬化，进而加重糖尿病肝损伤。近年来研究表明肝细胞凋亡是加速肝损伤的关键因素之一[1]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是广泛分布于生物体内的高度保守的蛋白激酶，具有抗氧化应激、抗炎、抗增殖和抗凋亡等多种生物学作用，可从多途径影响脂代谢，包括抑制脂肪酸与甘油三酯的合成，抑制胆固醇的合成以及促进脂肪酸氧化分解等，且AMPK在抑制肝细胞凋亡方面具有很重要作用[2]。Jung 等[3]与Wu[4]等均报道，AMPK的激活可抑制肝细胞过度氧化应激和改善线粒体功能。MicroRNA与脂质代谢密切相关，参与调控三酰甘油和胆固醇的合成、脂肪酸的氧化与合成、相关酶的活性等[5-6]。并有报道微小RNA-33(microRNA-33,miR-33)能够靶向沉默AMPK，控制甘油三酯的合成[7]。屈展[8]的研究亦表明，在人肝癌细胞(HepG2)中，miR-33可影响细胞内甘油三酯的水平，其可能机制为靶向结合AMPK沉默其表达来调控细胞内甘油三酯的代谢。利拉鲁肽(liraglutide，商品名Victoza，中文名“诺和力”)是长效人胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)类似物，其作为新型抗糖尿病药物已被广泛应用。研究表明利拉鲁肽除降糖，亦有多种作用，如可明显降低糖尿病大鼠肝脏内的脂质含量，减轻糖尿病大鼠肝脏病变；可减少游离脂肪酸和细胞因子诱导的β细胞凋亡[9]。本实验在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)C57BL/6小鼠模型上研究糖尿病肝损伤过程是否与miR-33-AMPK相关，且利拉鲁肽是否通过调控miR-33改善糖尿病肝损伤。

材 料 和 方 法

1 实验动物、试剂和仪器

雄性C57BL/6小鼠，18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为SCXK(京)2011-0001。利拉鲁肽购自诺和诺德制药有限公司，国药准字J20110026；血糖、总胆固醇(total choleste-rol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒生产于碧云天生物技术公司；I 抗GAPDH、AMPK、p-AMPK、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3及 II 抗购自CST；FITC荧光 II抗购自武汉奈德生命科技有限责任公司；Hoechst33342购自上海前生生物科技有限公司。低温超速离心机(Thermo)；Western blot电泳系统(Bio-Rad)；凝胶成像系统(Tanon)；荧光显微镜(OLYMPUS)；分析天平(METTLER TOLEDO)。

2 方法

2.1 动物分组、模型复制及给药 所有80只小鼠饲养于清洁级环境中，温度25 ℃，湿度55%～65%，维持12 h/12 h明暗交替。适应性喂养1周后，其中65只高脂喂养4周后，腹腔注射100 mg/kg链脲菌素(streptozocin，STZ)复制T2DM小鼠模型，4周后检测空腹血糖，选取血糖在7.8～15 mmol/L的45只小鼠纳入实验并随机分为3组，即模型组：T2DM小鼠皮下注射等量的生理盐水；利拉鲁肽低剂量组：T2DM小鼠皮下注射100 μg·kg-1·d-1利拉鲁肽；利拉鲁肽高剂量组：T2DM小鼠皮下注射200 μg·kg-1·d-1利拉鲁肽。其余15只正常小鼠作为对照组，皮下注射等量的生理盐水。给药4周后，摘眼球取血，3 500 r/min离心15 min，吸取上清保存于-80 ℃冰箱中待用。分离肝脏，一部分保存于-80 ℃冰箱，一部分固定于10%的甲醛溶液中待用。

2.2 生化指标的测定 小鼠禁食12 h后，眼眶静脉丛取血，检测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT 及AST含量。

2.3 口服葡萄糖耐量实验(oral glucose tolerance test，OGTT) 给药4周后进行OGTT，所有小鼠禁食过夜后，给予40%葡萄糖(2 g/kg)处理，分别于0 min、30 min、60 min、90 min和120 min眼眶静脉丛采取血样，3 500 r/min离心15 min，吸取上清用于测定血糖。

2.4 HE染色 将固定于10%甲醛溶液中的肝组织脱水后常规石蜡包埋，切片。切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，伊红染色，苏木精复染，梯度脱水，二甲苯透明，树脂封片，光镜下观察，进行病理学分析。

2.5 免疫荧光检测肝组织的cleaved caspase-3 将固定于10%甲醛中的肝组织脱水后常规石蜡包埋，切片。切片如下处理：二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，PBS洗5 min 3次，5%～10%山羊血清室温孵育30 min，0.3% Triton X打孔， I 抗cleaved caspase-3(1∶100)孵育过夜，PBS洗5 min 3次，荧光II抗(1∶200)室温避光孵育120 min，PBS洗5 min 3次，Hoechst 33342室温避光染色120 min，PBS洗5 min 3次，封片，显微镜下观察。

2.6 Western blot法检测AMPK及凋亡相关蛋白表达 提取肝组织蛋白，测定样品蛋白含量并稀释样本，配制5%浓缩胶、12%和15%分离胶，上样，电泳，转膜，于5% BSA或 5%脱脂奶粉封闭液于室温封闭2 h，TBST洗膜5 min 3次，加入I抗[AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)]，4 ℃冰箱过夜孵育，TBST洗膜5 min 3次，II 抗(1∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗膜5 min 3次，ECL化学发光法显色，使用Quantity One软件对结果进行分析。

2.7 Real-time PCR检测肝组织中miR-33水平 采用TRIzol两步法抽提小鼠肝组织总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录操作。采用20 μL反应体系，反应条件为：42 ℃ 30 min； 85 ℃ 5 min。所得cDNA于-20 ℃中保存待用。

采用real-time PCR 检测小鼠肝组织中 miR-33含量，以U6作为内参照。miR-33的上游引物为5′-GCCGTGCATTGTAGTTGC-3′，下游引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6的下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTGCG-3′,上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′。PCR反应条件为:95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min, 40个循环； 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 95 ℃ 15 s。miR-33含量按公式2-ΔΔCt计算。

3 统计学处理

统计学处理计量资料均以均数±标准误(mean±SEM)表示，使用SPSS 17.0软件进行数据统计。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为方差有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠血清生化指标的变化

与对照组相比，模型组小鼠血糖水平显著升高(P<0.01)，脂质代谢严重紊乱即血清中TC、TG、LDL-C、ALT及AST含量显著升高(P<0.01)，HDL-C含量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，利拉鲁肽高、低剂量组小鼠空腹血糖明显降低(P<0.05)，脂质代谢紊乱得到一定改善，即血清中TC、TG、LDL-C、ALT及AST含量明显降低(P<0.05)，HDL-C含量明显升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性,见表1。

表1 各组小鼠血清生化指标

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group.

2 葡萄糖耐量实验

对照组、模型组以及利拉鲁肽高、低剂量组小鼠血糖均在给予葡萄糖30 min后达到峰值，随后下降。与对照组相比，模型组小鼠血糖在各时点处在高水平状态；与模型组比较，利拉鲁肽高、低剂量组小鼠血糖水平有显著下降，且呈剂量依赖性。曲线下面积计算结果亦显示模型组明显高于对照组，而给药组明显低于模型组(P<0.05),见图1。

3 利拉鲁肽对糖尿病小鼠肝组织病理学变化的影响

对照组小鼠肝组织结构正常，肝细胞索、肝窦排列规则，且肝小叶分界明显，肝细胞胞质均匀，无颗粒、脂肪、纤维变性等；而模型组小鼠肝组织结构紊乱，肝细胞索、肝窦排列不规则，肝细胞肿大、轻度变形；给药组小鼠肝组织趋于正常，肝细胞索、肝窦排列较规则，且高剂量组治疗作用优于低剂量组,见图2。

Figure 1.Curves of blood glucose concentration versus time (A) and area under the curve (AUC; B) in oral glucose tolerance test (OGTT). Mean±SEM.n=15.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group.

图1 OGTT曲线及OGTT曲线下面积

Figure 2.Histological examination of liver in each group (HE staining, ×200). A: control; B: model; C: liraglutide (100 μg/kg); D: liraglutide (200 μg/kg).

图2 各组小鼠肝脏病理学检查

4 免疫荧光检测肝组织cleaved caspase-3的变化

与对照组比较，模型组小鼠肝组织绿色荧光强度明显增强，cleaved caspase-3明显增加；与模型组比较，利拉鲁肽高、低剂量组小鼠肝组织绿色荧光强度明显减弱，cleaved caspase-3明显降低，且呈剂量依赖性,见图3。

5 利拉鲁肽对肝组织AMPK及凋亡相关蛋白的影响

与对照组相比，模型组小鼠AMPK磷酸化水平显著降低，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达明显降低，凋亡相关蛋白caspase-3剪切水平明显增加，差异具有统计学显著性(P<0.01)；与模型组相比，利拉鲁肽高、低剂量组小鼠肝组织AMPK磷酸化水平明显升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达明显升高，凋亡相关蛋白caspase-3剪切水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性,见图4。

6 利拉鲁肽对肝组织miR-33表达的影响

与对照组比较，模型组小鼠肝组织中的miR-33含量显著增加(P<0.01)；与模型组比较，利拉鲁肽高、低剂量组小鼠肝组织中的miR-33含量明显降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性,见图5。

讨 论

继心血管疾病和恶性肿瘤之后，糖尿病作为第三大严重危害人类健康的疾病，其发病率在全球范围内逐年上升。糖尿病性肝损伤是一种常见的糖尿病并发症，但由于肝脏巨大的代偿功能，其临床表现隐匿，容易被忽视[10]。因此，明确糖尿病肝损伤的发病机制以及寻求有效的药物治疗具有非常重要的意义。

Figure 3.Expression of cleaved caspase-3 in liver detected by immunofluorescence. A: control; B: model; C: liraglutide (100 μg/kg); D: liraglutide (200 μg/kg).

图3 免疫荧光检测肝组织的cleaved caspase-3

Figure 4.Expression of AMPK, Bcl-2 and caspase-3 in liver of each group. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group.

图4 各组小鼠肝组织中AMPK及凋亡相关蛋白的表达

越来越多的研究表明胰岛素抵抗可能是糖尿病肝损伤的启动因素，外周胰岛素抵抗导致脂肪组织的脂解作用增强，肝脏内三酰甘油及游离脂肪酸的含量增加，从而诱导氧化应激并引起肝细胞的凋亡。进而，肝损伤又加重胰岛素抵抗，导致脂质过氧化、肝细胞炎症坏死及纤维化等[11-12]。AMPK是广泛分布于生物体内的高度保守的蛋白激酶，具有多种生物学作用，参与调控多种疾病的发生过程，在控制机体代谢平衡方面发挥重要作用。AMPK可从多种途径影响脂质代谢，包括抑制脂肪酸和甘油三酯的合成，抑制胆固醇的合成以及促进脂肪酸氧化分解等。此外，AMPK在抑制肝细胞凋亡方面具有很重要作用。

Figure 5.Expression of miR-33 in liver of each group. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM group.

图5 各组小鼠肝组织miR-33含量的变化

利拉鲁肽是长效人GLP-1的类似物，其作为新型抗糖尿病药物已广泛应用于临床。研究表明利拉鲁肽具有降血糖以外的多种作用，利拉鲁肽显著减少糖尿病大鼠肝脏内的脂质含量，减轻糖尿病大鼠肝脏病变；减少细胞因子和游离脂肪酸诱导的β细胞凋亡。

本文主要探讨利拉鲁肽通过调节miR-33-AMPK抑制肝细胞凋亡的作用机制。利拉鲁肽能够明显改善糖尿病小鼠肝脏病理变化，与模型组比较，HE染色结果显示利拉鲁肽组小鼠组织趋于正常，肝脏肝细胞索、肝窦排列较规则。利拉鲁肽能够显著降低糖尿病小鼠血糖血脂水平及脂质堆积，血清生化指标结果显示利拉鲁肽组FBS、TG、TC、LDL-C、ALT及AST含量明显降低，HDL-C含量明显升高。免疫荧光结果显示肝组织cleaved caspase-3明显降低，Western blot实验结果显示Bcl-2表达明显降低，caspase-3表达水平明显增加，其机制可能与利拉鲁肽通过降低肝组织miR-33水平，进而抑制AMPK磷酸化有关。

综上所述，糖尿病小鼠肝组织的miR-33含量增加，抑制AMPK磷酸化水平，加速肝细胞凋亡；利拉鲁肽可显著降低肝组织中miR-33的含量，进而使AMPK活化程度增加，抑制肝细胞凋亡。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Liraglutide ameliorates liver injury of type 2 diabetic mice via micro-RNA-33-AMPK pathway

GAO Na1, YANG Qing-yu2, LIU Xiu-mei2

(1DepartmentofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,2DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China.E-mail:gn_submit@163.com)

AIM: To observe the effects of liraglutide on the level of microRNA-33 (miR-33) and the expression of AMP-activated protein kinase (AMPK) and apoptosis-related proteins in mice with type 2 diabetes mellitus (T2DM), and to explore its possible mechanism. METHODS: High-fat diet and intraperitoneal injection of streptozocin were used to establish the type 2 diabetic model in C57BL/6 mice. The mice were randomly divided into 4 groups (n=15): in control group, the normal mice were subcutaneously injected with equivalent volume of saline; in model group, the T2DM mice were subcutaneously injected with equivalent volume of saline; in low- and high-dose liraglutide treatment groups, the T2DM mice were subcutaneously injected with 100 and 200 μg·kg-1·d-1, respectively. After 4 weeks of administration, the levels of FBG, TG, TC, HDL-C, LDL-C, ALT and AST were determined. HE staining was used to observe the pathological changes of the liver tissues. The protein level of cleaved caspase-3 in the liver tissue was detected by the technique of immunofluorescence. The protein levels of p-AMPK/AMPK and apoptosis-related proteins were detected by Western blot. The expression of miR-33 in the liver tissues was detected by real-time PCR. RESULTS: Compared with model group, the contents of FBG, TG, TC, LDL-C, ALT and AST were decreased significantly, while the content of HDL-C was increased significantly in low-dose liraglutide group and high-dose liraglutide group (P<0.05). The protein levels of phosphorylated AMPK and Bcl-2 were up-regulated significantly, and the expression of cleaved caspase-3 was down-regulated significantly (P<0.05). The level of miR-33 was decreased significantly (P<0.01). CONCLUSION: Liraglutide alleviates liver injury in type 2 diabetic mice, and the mechanism may be associated with reducing the level of miR-33 and increasing the phosphorylation of AMPK in the liver tissues, thereby inhibiting hepatocyte apoptosis.

Liraglutide; MicroRNA-33; AMP-activated protein kinase; Hepatocyte apoptosis

1000- 4718(2017)01- 0086- 06

2016- 04- 05

2016- 07- 13

R587.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.014

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0371-65587016; E-mail: gn_submit@163.com