猪伪狂犬基因缺失疫苗的的研究进展

薛 爽

（湖南省长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙410013）

猪伪狂犬基因缺失疫苗的的研究进展

薛 爽

（湖南省长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙410013）

猪伪狂犬病（Ps eudorabi es）是由伪狂犬病病毒(Ps eudorabi esvi rus，PR V)引起的多种家畜以发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍、脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病，给养殖业带来很大的危害。而对该病最有效的预防措施是采取疫苗免疫，疫苗免疫是预防该病的主要手段，临床上使用的疫苗又以猪伪狂犬基因缺失疫苗为主。文章就目前猪伪狂犬基因缺失疫苗的研究现状及主要的商品化基因缺失疫苗做一简要综述。

猪伪狂犬；基因缺失疫苗；商品化疫苗

猪伪狂犬病（Pseudorabi es）是由伪狂犬病病毒(Pseudorabi esvi rus，PRV)引起的多种家畜以发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍、脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。现在已有40多个国家报道40多种动物感染该病，我国自1948年刘永纯首次报道猪伪狂犬病以来，已有20多个省市报道此病的发生。近年来的研究报道表明，猪伪狂犬病的发生逐年增加，成为我国当前危害养猪业的重要疫病之一。

对于该病的防控最为有效的方法是疫苗免疫。目前临床上使用较多时是PRV基因缺失疫苗。PRV基因缺失疫苗是利用基因工程技术，在基因组中缺失或插入一段或几段序列使PRV的某些基因不能表达，从而致弱PRV，同时又保持其较强的免疫原性而制成的疫苗。随着研究的不断深入。目前已构建出了多种单基因、双基因及多基因缺失疫苗。

1 猪伪狂犬基因缺失疫苗研究进展

1.1 单基因缺失疫苗株

（1）TK基因缺失株：第一代基因缺失疫苗PRV的主要缺失的毒力基因是TK基因。TK基因缺失疫苗不存在毒力返强，使用安全。Ki t等[1]以PRV BUK为起始材料，并以BUK疫苗株为亲本通过缺失TK基因序列中的148bp片段，构建出PRV的 TK缺失株PRV BUK-d13株。试验证明，该疫苗对猪是安全的，并能提供有效的保护。1986年该毒株被美国批准为上市的第一个基因工程疫苗毒株。华中农业大学陈焕春[2]通过构建转移质粒pU EKPZ，将该质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK-15细胞，构建了PRV Ea株TK基因缺失株。苏鑫铭等[3]构建了PRV上海株TK基因缺失株，并对其生物学特性有部分的研究。PRV上海株缺失TK基因后不影响病毒的增殖，同时，对小鼠的致死能力很低，甚至失去对小鼠的毒力，但是对猪仍然具有感染力。陈瑞爱等[4]利用PCR构建猪伪狂犬病毒容A株（PRV-Ra）TK基因缺失重组病毒，该重组病毒在体外传代30代后仍其有良好的遗传稳定性。

（2）gE基因缺失疫苗株：张松林等[5]将中间转移载体pl ESE和伪狂犬病毒Ea株基因组共转染构建了Ea株gE基因缺失突变株，并证明该缺失突变株在体外能够稳定遗传。目前市面上流通的商品苗大多都是gE基因缺失苗Bart ha株。Bart ha株是一株弱毒活疫苗，是国外从牛身上分离的伪狂犬病毒gE基因缺失Bart ha株为基础研制的疫苗。

（3）gD基因缺失疫苗株：华中农业大学石德时[6]采用真核表达质粒介导的方法与逆转录病毒介导的方法构建了一种新型PRV gD基因缺失株。1994年Peet ers等[7]构建一株gD基因缺失株。病毒能够直接在细胞和细胞间转移，但是感染细胞释放的子代病毒无感染性，缺失gD的毒株将失去从免疫动物向非免疫动物传染的能力，对接种猪能产生明显的保护性，证明gD缺失突变株是一种安全、不散毒的活疫苗。

（4）gG基因缺失株：河南农业大学王鑫等[8]利用脂质体介导的方法，将转移载体质粒PUSG与PRV基因组DNA共转染PK-15细胞，构建出含GFP报告基因的伪狂犬病病毒Ea株gG基因缺失重组病毒。

1.2 双基因缺失株

第二代基因缺失疫苗除了缺失了主要的毒力TK基因外，还缺失了一个编码非必需糖蛋白的基因，有些同时在缺失双基因的基础上插入一个报告基因LacZ+或GFP（报告基因编码绿色荧光蛋白，能自身催化形成发光结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。

(1)TK/gC双基因缺失活疫苗：1987年Ki t等[9]在PRV BUK-d13株的基础上，通过缺失gC基因序列的l100bp，构建了PRV TK/gC一双基因缺失疫苗株。动物试验表明，用该缺失疫苗接种的动物不能产生抗gC的抗体，用gC-ELISA可将接种动物与自然感染动物区分开，有利于检疫工作的开展。

(2)TK/gG双基因缺失活疫苗：在我国，陈焕春、刘正飞等[10]以国内地方分离株鄂A株为亲本，采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切,构建了缺失主要毒力TK基因重组质粒pSTK1-4,经过转移质粒改造，用Ecol R1消化PRV鄂A株TK/LacZ+突变株基因组DNA，然后转染PK-15细胞构建了TK-/LacZ+突变株重组病毒，进一步提取TK缺失突变株基因组DNA,通过磷酸钙法与含gG-LacZ转移质粒共转染PK-15细胞建立了PRV EaTK/gG一疫苗株。测定结果表明：该毒株具有较好的安全性，良好的遗传稳定性，很强的免疫原性，可以作为候选毒株用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。目前，由陈焕春主持构建的PRV EaTK/gG一疫苗株已按新兽药证书的要求完成了中试与区域试验，经动物实验和中试应用证明该产品在产生抗体的时间和保护效果优于目前的国内外同类产品，命名为该疫苗株为PRV H B-98突变株，经过8年实验室试验和临床试验，于2006年获得国家新兽药注册证书和生产许可证[11]。

(3)TK/gE双基因缺失活疫苗：梁苑燕等[12]以PRV-JSZ株为亲本毒株，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因，以Cre/l oxP系统，可先构建出带有l oxP位点的rPRV-gE-/GFP，通过Cre重组酶处理后，获得剔除EG-FP的gE单缺失株rPRV-gE一；再以rPRV-gE一为母本，以相同方法构建gE/TK双基因缺失株rPRV-gE/TK一株。刘正飞等用gE转移质粒pSPFZ与PRV EaTK一基因组DNA共转染猪肾传代细胞IBRS-2,在X-gal存在下进行蓝斑筛选,挑取蓝班进行空班纯化,空班纯化三次后获得重组病毒PRV EaTK/gE一/LacZ+突变株。

1.3 三基因缺失活疫苗

2003年由郭万柱主持陈陆等[13]通过对其PRV闽A株TK基因缺失株改造构建了gE/gI/TK/LacZ+三基因缺失疫苗株(SA215)，通过对该株致细胞病变效应、安全性、免疫原性和接种动物抗体消长规律等生物学特性测定及田间试验结果显示，SA215株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。目前，SA215株正式获得国家新兽药证书。

1.4 四基因缺失活疫苗

M et t enl ei t er等构建了含gG、gD、gE、gI缺失的4基因缺失疫苗株。1994年，M et t enl ei t er等[14]利用已整合PRV gD的细胞系，构建了gG/gE/gI/gD四基因缺失疫苗，该疫苗不会散毒，非常安全，对猪失去毒性，能刺激机体产生对PRV的保护性免疫。

2 国内外主要商品化猪伪狂犬基因缺失苗

随着猪伪狂犬基因缺失疫苗技术的研究成功，商品化的猪伪狂犬疫苗也随着出现。目前，市场上主要流通的毒株是Bart ha毒株和Bucharest毒株。同时，市面主要流通的疫苗种类是：弱毒活疫苗，是以国外引进的分离自牛的伪狂犬病毒gE基因缺失的Bart ha株为基础研制的基因缺失疫苗、华中农业大学陈焕春研究的TK/gG一双基因缺失（H B-98株）疫苗毒株疫苗和美国辉瑞林肯厂使用的Bucharest毒株疫苗。

目前，国内已获得批文的猪伪狂犬基因缺失疫苗生产厂家有15家，部分生产厂家具体信息见表1。国内流通的进口猪伪狂犬基因缺失疫苗的生产厂家有6家，具体信息见表2。

表1 部分国产猪伪狂犬基因缺失活疫苗的信息表

表2 进口猪伪狂犬基因缺失活疫苗的信息汇总表

3 小结与展望

随着猪伪狂犬基因缺失疫苗在生产实践中的广泛使用，该基因缺失疫苗与传统灭活苗相比，其优势也越来越明显。猪伪狂犬基因缺失疫苗的优势主要表现在：①基因缺失疫苗稳定，不易发生毒力返祖增强；②PRV基因缺失株毒力低，但免疫原性强，保护时间长；③可用于疫苗免疫动物与自然感染动物的鉴别诊断。当然，猪伪狂犬基因缺失疫苗也存在引起潜伏感染和排毒等方面的危险性。但随着基因缺失疫苗的研究和应用，通过对免疫程序、免疫方式、免疫佐剂等的改变，结合血清学抗体检测技术和野毒鉴别技术，最终通过整体的猪伪狂犬净化方案，从而根除猪伪狂犬病。

[1]Kit S,Kit M,Pirtle E C.Attenuated properties of thymidine kinase-negative deletion mutant of pseudorabies virus[J].Am J Vet Res, 1985,46(6)：1359-1367.

[2]周复春,陈焕春,方六荣,等.伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定[J].中国兽医学报,1999,(5)：417-420.

[3]苏鑫铭.伪狂犬病病毒上海株TK基因缺失株的构建及其生物学特性初步研究[D].南京农业大学,2003.

[4]陈瑞爱,邵定勇,韩静芳.猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV/TK-的构建及其生物学特性[J].中国兽医学报.2010,30(5)：577-582.

[5]张松林.伪狂犬病gE～-/gI～-基因缺失突变株及禽流感假病毒的构建以及免疫效果的研究[D].华中农业大学,2008.

[6]石德时.伪狂犬病毒Ea株gD基因转基因细胞系的构建及其人工感染仔猪的病理学[D].华中农业大学,2004.

[7]Moormann R J,de Rover T,Briaire J,et al.Inactivation of the thymidine kinase gene of a gI deletion mutant of pseudorabies virus generates a safe but still highly immunogenic vaccine strain[J].J Gen Virol,1990,71(7)：1591-1595.

[8]王鑫.含GFP报告基因的伪狂犬病病毒Ea株gG基因缺失重组病毒的构建[D].河南农业大学,2008.

[9]Kit S,Sheppard M,Ichimura H,et al.Second-generation pseudorabies virus vaccine with deletions in thymidine kinase and glycoprotein genes[J].Am J Vet Res,1987,48(5)：780-793.

[10]刘正飞，陈焕春，吴斌，等.伪狂犬病病毒鄂A株TK～-/gE～-/ gI～-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究[J].畜牧兽医学报，2004, 35(1)：70-73.

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[12]梁苑燕,胡艳芬,张小荣,等.应用Cre-loxP系统构建伪狂犬病病毒gE/TK双缺失株[J].畜牧兽医学报,2012,43(11)：1802-1809.

[13]陈陆,郭万柱,徐志文,等.伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)生物学特性研究[J].畜牧兽医学报，2005,36(3)：278-282.

[14]Mettenleiter T C,Spear P G.Glycoprotein gB(gII)of pseudorabies virus can functionally substitute for glycoprotein gB in herpes simplex virus type 1[J].J Virol,1994,68(1)：500-504.

S852.659.1

A

1006-4907（2016）04-0047-03

10.3969/j.i ssn.1006-4907.2016.04.024

2016-05-09

薛爽(1987～),男,汉族,本科,助理兽医师,现从事动物疫病预防领域工作,1026689455@qq.com.