狼源和羊源长角血蜱体内菌群分析

唐 莲，江叔芳，唐 欢

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

狼源和羊源长角血蜱体内菌群分析

唐 莲，江叔芳，唐 欢※

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

采用PC R-D G G E技术分析狼、羊长角血蜱体内携带菌群情况。无菌条件下将样品用液氮研磨成粉，试剂盒提取细菌总D N A；通用引物扩增细菌16S rD N A V3区并进行D G G E电泳，分析、选取7条优势条带，回收克隆测序。结果显示，狼、羊长角血蜱体内共携带7种优势菌，其中兰斯格军团杆菌（Legionella lansingensis）、皮可克立克次氏体（Rickettsia peacockii）、R SV70AB1-2细菌（Bact eri um SV70AB1-2）、J N C ZJ b F1细菌（Bact eri um J N C ZJ b F1）为二者共有；不动杆菌属（Acinetobacter sp）和一种不可培养的细菌存在于狼源长角血蜱体内；拉乌尔特立克次氏体（Rickettsia raoultii）存在羊源长角血蜱体内。长角血蜱寄生在不同宿主体内所携带优势菌群存在一定差异。

PC R-D G G E；长角血蜱；微生物菌群

蜱（Ti ck）是一类依靠吸食动物血液为生的体外寄生虫，隶属节肢动物门、蛛形纲、蜱螨目，蜱总科，蜱总科分为软蜱科、硬蜱科、纳蜱科三种。全世界已知蜱类有3科18属897种，中国有2科10属119种[1]。长角血蜱分孤雌生殖[2]和两性生殖2个种群，是我国的优势蜱种之一，广泛分布于我国17个省市区[3]。它侵袭人和黄牛、马、绵羊、山羊、犬、鹿、刺猬等多种动物，是伊氏埃立克体[4]、嗜吞噬细胞无形体[5]、发热伴血小板减少综合征病毒[6]、瑟氏泰勒虫等多种病原体的传播媒介，具有重要的流行病学意义。目前，长角血蜱寄生在不同宿主携带菌群情况报道较少。本文采用PCR-DGGE技术，旨在揭示狼、羊长角血蜱体内携带菌群结构，为防治蜱及蜱传染病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 长角血蜱

样品分别采自湖南省长沙市生态动物园狼体表和河南省信阳市家羊体表，经体视显微镜和分子生物学鉴定为长角血蜱，样品液氮中保存。

1.1.2 主要试剂及仪器

2×EasyTaq PCR SuperM i x,由北京全式金生物技术有限公司出品；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA片段快速纯化/回收试剂盒，由天根生化科技（北京）有限公司出品；变性梯度凝胶电泳仪系统（DGGEK-2001），由美国CBS公司；凝胶成像系统（Quant um ST5），由法国Vi l berl ourm at公司出品。

1.1.3 扩增引物

以341f和907r为引物扩增16SrDNA,其序列为：341f（5’-CCTACGGAGGCAGCAG-3’）/907f(5’-CC CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’)；以341f-GC/518R为引物，扩增16SrDNA V3其序列为：341f-GC（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGG CCTACGGAGCAGCAG-3’）/518R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)。

1.2 方法

1.2.1 细菌DNA的提取

分别采自狼、羊体表长角血蜱饱血、半饱血雌成蜱若干，用75％乙醇清洗消毒，将样品于液氮研磨成粉。参照细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.2 细菌16S rDNA V3区的扩增与纯化

以341f和907r为引物，分别扩增狼、羊长角血蜱体内细菌DNA。反应体系（50μL）：细菌DNA 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperM i x25.0 μL，ddH2O 21.0 μL。反应参数：94℃预变性5m i n；94℃预变性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸34s；34个循环；72℃延伸7m i n。取5.0 μL产物用于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

以第一次PCR产物为模板，341f-GC和518R为引物扩增狼、羊长角血蜱体内细菌16S rDNA V3区。反应体系（50μL）为：第一次PCR产物1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×TransH i FiSuperM i x 25.0 μL，ddH2O 22.0 μL。扩增条件：95℃预变性5m i n；95℃预变性30s，66℃退火30s，72℃延伸12s；32个循环；72℃延伸7m i n。取5.0 μL产物用于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用DNA片段快速纯化/回收试剂盒回收。

1.2.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）

制备6％（w/v）的聚丙烯酰胺凝胶，取纯化扩增产物10μL加入凝胶样品孔进行电泳。电泳条件：60℃、200V，1×TAE电泳10h。EB染色20m i n后，用Quant um ST5凝胶成像系统仪拍照。

1.2.4 切胶回收与测序

从DGGE凝胶切下优势条带，用ddH2O清洗3次后捣碎，再加入50μL无菌水，置于4℃条件过夜。将过夜产物于12 000×g离心5m i n，收集上清液。以此为模板，用引物341f和518R进行16S rDNA V3区PCR扩增。扩增参数：95℃预变性5m i n；95℃预变性30s，53℃退火30s，72℃延伸12s；32个循环；72℃延伸7m i n。取5.0 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳检查，以DNA片段快速纯化/回收试剂盒回收PCR产物，纯化产物送华大基因公司测序。

1.2.5 数据处理

将公司所测序列用DNAm an比对、分析，全长序列上传至GeneBank数据库，Bl ast n搜索同源性和相似性最高的序列。

2 结果分析

2.1 细菌16S rD N A PC R结果

以341f和907r为引物扩增采自狼、羊长角血蜱体内细菌总DNA，其片段大小约为600bp，与预测大小一致（图1）。

图1 长角血蜱体内细菌16S rD N A PC R扩增结果（M：M arker;1：羊源长角血蜱;2：狼源长角血蜱;N：阴性对照）

2.2 细菌16S rD N A V3区PC R扩增结果

以341f-GC和518R为引物扩增细菌16SrDNA V3区，其片段大小约为250bp,与预测大小相符(图2)。

图2 长角血蜱体内细菌16SrD N A V3区PC R扩增结果(M：M arker;1：羊源长角血蜱;2：狼源长角血蜱)

2.3 细菌16S rD N A V3区D G G E电泳图谱分析

狼、羊长角血蜱体内细菌16S rDNA V3区DGGE电泳如图3。由图可知，狼、羊长角血蜱体内共携带7条优势菌，其中条带2、条带3、条带5、条带6为二者共有，条带1、条带7仅存在狼源长角血蜱体内，条带4仅存在羊源长角血蜱体内。详细见表1。

图3 狼、羊长角血蜱体内细菌D G G E电泳图(N：阴性对照;1：狼源长角血蜱;2：羊源长角血蜱)

表1 D G G E凝胶中回收条带序列分析结果

2.4 结果分析

本实验采集了7个优势条带，经华大基因公司测序后，获取的基因序列与Genbank中登录的基因序列比对的结果如表1。从表1可以直观看出，狼、羊长角血蜱体内的主要优势菌为不动杆菌属（Acinetobacter sp）、兰斯格军团杆菌（Legionella lansingensis）、立克次氏体（Rickettsia）、SV70AB1-2细菌（Bact eri um SV70AB1-2）、JNCZJb F1细菌（Bact eri um JNCZJb F1）和一种不可培养的细菌，与Genbank数据库已知序列具有高度的同源性和相似性。结果表明，狼源和羊源长角血蜱体内携带的优势菌存在一定的差异，狼源相对二者共有菌多出2种，而羊源只多出一种。

3 讨论

动物胃肠道内寄生着大量的的微生物菌群，采用传统的方法无法准确分析物种丰度和均匀度[7]。目前，荧光原位杂交(FISH)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、基因的限制性片段长度多态性(RFLP)、荧光定量PCR等分子生物学技术已经广泛应用于动物胃肠道微生物研究领域[8]。但在蜱肠道微生物研究方面，DGGE报道较少[9]。本文采用PCR-DGGE技术分析狼、羊长角血蜱体内携带菌群情况。

本次实验从狼、羊长角血蜱体内检测到7种优势菌，它们分别为不动杆菌属、皮可克立克次氏体、RSV70AB1-2细菌、兰斯格军团杆菌、JNCZJb F1细菌、拉乌尔特立克次氏体（R.raoultii）及一种不可培养的细菌。对于吸血的节肢动物而言，肠道菌群在不断变化，吸血后，中肠细菌群体会经历先增后减的过程[10]。李春红[11]等采用细菌学方法从未吸血的长角血蜱肠道内分离到5个菌属：葡萄球菌属、考克氏菌属、短杆菌属、显核菌属和微杆菌属；廖芷卉[9]等采用PCR-DGGE技术对羊源长角血蜱吸血后中肠优势菌群进行检测，分离到7个菌属：柯克斯氏体属、肠杆菌属、泛菌属、绿脓杆菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属，此二者研究证实，长角血蜱肠道菌群在在吸血前后存在差异。除此以外，同一种蜱在不同生长发育阶段、不同的地域体内菌群结构也有所不同。杨亚[12]等从河南信阳、湖南岳阳、山西太谷地区褐黄血蜱中肠内容物中检测发现：半饱血雌成蜱和吸血雄成蜱中肠菌群结构基本相同，但饱血雌成蜱3个地区间具有较大的差异。本次实验结果表明，长角血蜱寄生在狼、羊宿主所携带菌群之间存在差异。

从长角血蜱分离到的细菌，在其他蜱中也有报道。Ni ebyl ski[13]等从安氏革蜱中检测到了皮科克立克次，W en等[14]证实，从我国黑龙江地区的森林革蜱体内含有R raoultii。唐昊等[15]从微小牛蜱中肠内容物中分离到2株立克次氏体：斯洛伐克立克次氏体、拉乌尔特立克次氏体，其它蜱如篦子硬蜱，褐黄血蜱、镰形扇头蜱、中华革蜱等都是类似报道。皮科克立克次体为蜱虫胞内共生菌，对蜱虫的生长和发育有着重要作用；拉乌尔特立克次氏体属斑点热群立克次氏体，它能够引起人和动物发生坏死红斑和淋巴结病[16]；兰斯格军团杆菌它能够引起肺炎；不动杆菌容易引起创口发炎。由此可见，长角血蜱即是保菌宿主也是传播媒介。

综上所述，狼、羊长角血蜱体内携带菌群存在差异，可为蜱及蜱传染病的防治提供参考。

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S852.746

C

1006-4907（2016）04-0036-04

10.3969/j.i ssn.1006-4907.2016.04.020

2016-05-31

湖南省教育厅项目（N o.14B092）。作者简介：唐莲(1990～)，女，本科，动物医学专业，m 15974244003@163.com。

※通讯作者：唐欢(1990～)，男，硕士研究生，主要从事蜱及蜱传病研究，13975814172@163.com。