胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞与胰腺癌-树突融合细胞激发特异性细胞毒T淋巴细胞能力的比较研究

陈 江 李宏宇 王 迪 许文达 郭晓钟

胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞与胰腺癌-树突融合细胞激发特异性细胞毒T淋巴细胞能力的比较研究

陈 江 李宏宇 王 迪 许文达 郭晓钟

目的比较人胰腺癌MiaPaCa-2细胞总RNA电转染树突细胞（Dendritic Cell,DC）与DCM iaPaCa-2融合细胞体外激发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）能力的差异。方法自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DC。使用电穿孔法将M iaPaCa-2细胞总RNA转染DC，使用细胞融合方法将胰腺癌M iaPaCa-2细胞抗原负载DC，以未负载抗原的DC为对照。使用流式细胞术（FCM）检测PE-MUC/FITC-CD86抗体双标细胞评估融合效率；四甲基偶氮唑盐（MTT）检测转染各组DC存活率；混合细胞培养法评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖能力；ELISA法检测各组DC体外激发抗原特异性CTL因子释放量。结果采用PEG-DMSO诱导的DC与M iaPaCa-2的融合细胞同时表达DC表型和MUC1分子，CD86与MUC1双阳性表达率为（42.3±7.30）%;融合细胞组DC存活率呈时间依赖性下降，转染后96h的存活率降低至62.81%，而M iaPaCa-2总RNA转染组DC细胞存活率稳定在85%左右，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）；转染M iaPaCa-2总RNA DC刺激自体T细胞增殖指数（DC∶T=1∶10）为8432±611.25，显著高于DC-MiaPaCa-2融合细胞（DC∶T=1∶10）5672±107.51（P＜0.05）；且MiaPaCa-2总RNA转染DC激发特异性CTL分泌IL-12p70、IL-10和IFN-γ细胞水平亦显著异于DC-M iaPaCa-2融合细胞（P＜0.05）。结论胰腺癌细胞总RNA转染DC较胰腺癌-树突融合细胞有更强的体外抗原特异性CTL激发能力。

树突细胞；RNA转染；细胞融合；胰腺肿瘤；细胞毒性T淋巴细胞

胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，多数病例在发现时已属晚期，手术治疗及放、化疗作用有限，患者预后极差，临床迫切需要探索新的有效治疗手段[1]。树突细胞（Dendritic cell,DC）是体内功能最为强大的抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APS），能够刺激并致敏T淋巴细胞，产生细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lynphocytes,CTLs），是机体免疫应答的核心。近年来出现的以DC为基础构建的肿瘤疫苗技术对多种肿瘤均有显著的治疗作用，为胰腺癌的临床治疗开辟了新的思路[2-4]。肿瘤细胞总RNA转染DC疫苗和DC-肿瘤细胞融合疫苗是当前DC肿瘤疫苗构建免疫治疗的两个热点方向[5]。本研究通过比较人胰腺癌M iaPaCa-2细胞总RNA电转染DC和DC-M iaPaCa-2融合细胞体外激发抗原特异性CTL能力的差异，为临床选择更为高效的DC肿瘤疫苗构建策略提供前期实验依据。

材料与方

一、一般材料及试剂

筛选2014年6月至2016年1月期间沈阳军区总医院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者，男性4例，女性2例，年龄35～65岁，平均年龄50岁。全部患者均经组织病理学检查（剖腹探查活检4例，细针穿刺活检2例）证实为胰腺癌。入选前未经放、化疗及免疫治疗。所有患者均签署知情同意书，并经本院伦理委员会批准。

人胰腺癌细胞株M iaPaCa-2（沈阳军区总医院消化科实验室）；RPM I 1640、小牛血清（Hyclone公司，美国），rhGM-CSF、rhIL4、TNFα（PeproTec公司，美国），鼠抗人CD80、HLA-DR、CD83和CD86单抗（Santa-Cruz公司，美国），兔抗人MUC1多克隆抗体（DPC-Biermann公司，德国），TRIzol、MTT、50%PEG-10%DMSO溶液、Ficoll淋巴细胞分离液（Sigma公司，美国），3H标记甲基胸腺嘧啶（中科院原子能所），IL-12p70、IL-10、TNF-α和IFN-γ细胞因子检测试剂盒（BD公司，美国）。

二、DC的分离、培养和鉴定

参照文献[6]方法，通过Ficoll密度梯度离心法，分离来自胰腺癌患者100m L外周血中单核细胞（PBMCs），贴壁1 h后，取出未贴壁的细胞另作培养备用。贴壁细胞继续培养20 h后，更换新鲜培养液，加入rhGM-CSF（800 IU/m L）和rhIL-4（500 IU/ m L）。37℃，5%CO2，培养5 d后加入TNF-α（10 ng/ m L），培养至7 d，收集成熟DCs。使用倒置显微镜和电镜连续观察体外培养5～10 d DCs形态学变化。

三、胰腺癌M iaPaCa-2细胞总RNA提取、鉴定和转染

收获M iaPaCa-2细胞，加入Trizol试剂1m L充分裂解，5m in后加入氯仿200μL，4℃12 000 r/ m in离心15m in，加入异丙醇500μL，室温放置20 m in，4℃12 000 r/m in离心15m in，弃上清，加入75%乙醇1m L漩涡器震荡混均，4℃12 000 r/m in离心15 m in。弃上清，超净台晾干后溶于25μL DEPC水。分光光度计测定A260/A280值，计算RNA纯度和含量，1%变性凝胶电泳测RNA完整性后-80℃保存。

[7]的方法，取200μL培养5 d的未成熟DCs细胞悬液加入2mm的电极杯，加入20μg M iaPaCa-2总RNA。调整电压300 V、间隔125ms、4个脉冲，持续250ms进行电转染。电穿孔后立刻置入4℃冰箱静置10min，移入加有完全培养基的12孔培养板中，37℃、5%CO2培养0～96 h。以未转染RNA的mock-DC作为对照组。

四、细胞融合

选取连续传代培养20代后仍能稳定表达MUC1蛋白[8]的M iaPaCa-2细胞，使用25μg/m L丝裂霉素处理30m in，去增殖后与培养5 d的DC以3∶1混合，离心尽量吸尽上清，置37℃水浴中，滴加预热的50%PEG-10%DMSO溶液0.8m L，作用2 m in后加入1m L血清终止反应，未排除细胞间粘附及DC吞噬M iaPaCa-2细胞对实验结果的影响，以不加融合剂的mock-DC为对照。收集培养细胞，采用FITC-CD86及PE-MUC1双标记法，经流式细胞仪检测细胞融合率，融合率（%）=（融合组双标率-共培养组双标率）×100%。同时，使用MTT法检测各组DC存活率变化。

五、DC标志物检测

使用流式细胞法，分别检测转染M iaPaCa-2细胞总RNA及与M iaPaCa-2细胞融合后48 h的DC特异性标志物CD80、DC特征性成熟标志CD83、共刺激分子CD86以及MHC类分子HLA-DR等的表达水平，比较两者差异。

六、不同RNA转染组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖实验

分别收集不同转染组DCs，调节细胞浓度为1 ×105/m L作为刺激细胞，分选并调节患者自体PBMCs中的悬浮T淋巴细胞，浓度为1×106/m L作为反应细胞，按照刺激与效应细胞l∶10，l∶20，l∶40和l∶80比例加入到96孔板中，终体积200μL，在37℃，5%CO2培养5 d，收获细胞前18 h加入3HTdR，每孔1μCi。以RPM I-1640培养基替代效应细胞的4个孔作为对照组，使用液闪烁仪检测每分钟脉冲数（CPM）。

七、不同RNA转染组DC体外激发抗原特异性CTL释放细胞因子

以不同转染组DC为刺激细胞，以患者自体T淋巴细胞为效应细胞，刺激与效应细胞按l∶10比例混合反应14 d后，应用ELISA法，按试剂盒操作说明书检测细胞培养上清中IL-12p70、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平。细胞培养上清用试剂盒中样本稀释液稀释50倍后检测。每个样本设3个复孔，取平均值。

八、统计学处理

图1 体外培养DC及胰腺癌M iaPaCa-2细胞形态表现

结 果

一、DC与M iaPaCa-2细胞的体外培养和鉴定DC经体外分离、培养，数量可达初始数量的10～15倍。镜下可见胞体向四周伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起，部分突起末端呈球状膨大（图1 A、B）M iaPaCa-2细胞呈集落样生长，条索状，异型性明显（图1 C）。

二、融合细胞的鉴定与融合率的检测

倒置显微镜下可见，经50%PEG-10%DMSO溶液诱导融合后，部分DCs与M iaPaCa-2细胞先发生细胞膜融合，形成双核的巨大细胞，而后细胞核逐渐发生融合，形成DC与M iaPaCa-2细胞的杂交细胞（DC-M iaPaCa-2）。

M iaPaCa-2为MUC1阳性细胞，不表达CD86抗原；而CD86为成熟DC特异性表面标志物之一，DC为CD86阳性细胞，不表达或低表达MUC1抗原。采用FITC-CD86及PE-MUC1双标记法检测融合细胞，结果示融合细胞组CD86及MUC1双阳性的DC比率为（42.3±7.30）%（图2），而共培养组CD86及MUC1双阳性DC比率为（7.21±1.06）%，除去细胞粘附等因素作用，DC-M iaPaCa-2融合细胞形成率为（35.09±6.24）%。

三、DC存活率变化情况

M iaPaCa-2细胞总RNA转染后0～96 h，DC存活率变化较小，稳定在85%左右，而M iaPaCa-2细胞与DC融合后，融合细胞存活率呈现时间依赖性降低，96 h时，DC-M iaPaCa-2融合细胞存活率低至61.23%（P＜0.05），见图3。

四、不同分组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖实验

以M iaPaCa-2总RNA转染DC、DC-M ia-PaCa-2融合细胞及mock-DC作为刺激细胞，各组刺激细胞与自体T淋巴细胞混合培养，结果显示在DC∶T=1∶10时，DC-M iaPaCa-2 RNA细胞刺激自体T细胞增殖指数为8432±611.25，显著高于DCM iaPaCa-2融合细胞的5672±107.51（P＜0.05）及Mock-DC的257±32.16（P＜0.05）；且在DC∶T=1∶20时，DC-M iaPaCa-2 RNA组细胞刺激自体T细胞增殖指数为5852±153.03，亦高于DC-M iaPaCa-2融合细胞组的4276±130.01（P＜0.05）及Mock-DC组的108±17.18（P＜0.05）；而当DC∶T=1∶40及1∶80时，DC-M iaPaCa-2 RNA组细胞与DC-M ia-PaCa-2融合细胞刺激自体T细胞的增殖指数无显著差异（P＞0.05）（图4）。

图2 与M iaPaCa-2细胞融合前后DC内CD86、MUC1双抗原相对表达情况

图3 不同分组DC存活率变化情况[转染后96 h，DCM iaPaCa-2细胞融合组细胞存活率显著低于M iaPaCa-2总RNA转染组DC（*P＜0.05）]

图4 DC-MiaPaCa-2融合组，DC-MiaPaCa-2RNA转染组及M ock-DC组细胞刺激自体T细胞增殖实验

五、不同分组DC体外激发抗原特异性CTL释放细胞因子

M iaPaCa-2总RNA转染组DC、DC-M iaPaCa-2融合细胞及Mock-DC均具有刺激抗原特异性CTL分泌Th1型细胞因子的能力，但Mock-DC对CTLs的刺激作用较弱，几可忽略不计。ELISA法检测示，在DC∶T=1∶10时，M iaPaCa-2总RNA转染组DCs能激活自体特异性T细胞，其诱导特异性CTLs分泌IL-12p70和IFN-γ水平，显著高于DCM iaPaCa-2融合细胞（P＜0.05）；而M iaPaCa-2总RNA转染组DCs诱导特异性CTL分泌的IL-10水平，显著低于DC-M iaPaCa-2融合细胞；TNF-α水平两组间无显著变化（图5）。

图5 DC∶T=1∶10时，DC-M iaPaCa-2RNA转染细胞诱导特异性CTL分泌IL-12p70和IFN-γ水平显著高于DCMiaPaCa-2融合细胞，IL-10水平则明显低于DC-M iaPaCa-2融合细胞（*P＜0.05）

讨 论

DC肿瘤疫苗的实质是以特异性T细胞为基础的细胞免疫，而胰腺癌DC疫苗构建的关键在于选择合适的肿瘤抗原。胰腺癌缺乏特异性肿瘤抗原、异质性大、免疫原性差，使用单肿瘤抗原负载DC构建胰腺癌肿瘤疫苗时，其诱导的免疫反应通常较弱；而使用肿瘤全抗原负载DC构建胰腺癌疫苗则可激活针对不同肿瘤特异性抗原的多克隆细胞，减少肿瘤细胞克隆变异引起的抗原缺失，从而可以减少免疫逃逸的发生率，理论上是较具优势的DC肿瘤疫苗的构建策略[9]。

肿瘤细胞总RNA电转染DC疫苗与肿瘤-DC融合细胞疫苗，是当前临床研究中受关注较多的两种癌细胞全抗原负载DC疫苗制备方案。肿瘤-DC融合细胞是通过细胞融合技术将肿瘤细胞抗原导入DC，获得的杂交细胞既有DC的表面特征和功能，又能内源性表达肿瘤相关蛋白。负载有肿瘤细胞全抗原的DC能够体外激活T淋巴细胞多克隆性增殖，并促进相关CTLs分泌大量功能性细胞因子。而肿瘤细胞总RNA电转染DC，是通过RNA电转染技术，将含有肿瘤细胞全部抗原信息的总RNA导入DC胞内，在胞浆内对相关抗原基因进行转录，翻译，最终将肿瘤细胞抗原信息表达于DC表面，呈递并激活相关CTLs，实现特异性抗肿瘤免疫效应。

肿瘤-DC融合细胞疫苗的优势包括：①DC-肿瘤融合细胞能表达整个肿瘤细胞抗原决定簇，因而能诱导产生多克隆的CTL反应；②DC-肿瘤融合细胞既表达肿瘤抗原，又表达包括MHC、共刺激信号分子在内的DC表面抗原，使细胞介导的抗肿瘤免疫应答大大增强[10]；③DC-肿瘤融合疫苗能够将已知和未知的肿瘤相关抗原加工后呈递给T淋巴细胞，发挥最佳的抗肿瘤免疫作用；④DC-肿瘤细胞融合后其抗原呈递作用持久[11]，可诱导出更强的免疫应答反应。而肿瘤细胞总RNA转染DC疫苗的优势体现在：①转染的RNA只进入DC胞浆而非胞核，对细胞的损伤小；②RNA半衰期短，RNA转染DC疫苗更为安全；③负载的肿瘤抗原可从很少的癌细胞中经PCR扩增得来、RNA模板本身可经进一步的序列修饰，稳定性较强等[12]。RNA电转染法则更具有操作简单、安全、不受MHC遗传背景影响等优点[13]。

我们的研究发现，利用肿瘤细胞总RNA电转染技术，胰腺癌M iaPaCa-2细胞总RNA能够成功负载DCs，且转染过程中未出现抗原不良交互反应。而利用50%PEG-10%DMSO诱导DC的细胞融合技术，可使DC-M iaPaCa-2融合细胞的融合效率大于40%，凸显了该方法的有效性。胰腺癌M ia-PaCa-2细胞总RNA转染后0～96 h，DCs存活率稳定在85%左右，DC与胰腺癌M iaPaCa-2细胞融合后，细胞存活率在不同的时间点明显降低，提示此现象可能与50%PEG-10%DMSO融合剂对DCs的毒性蓄积和细胞膜的破坏作用有关。使用此两种方法负载胰腺癌M iaPaCa-2细胞总抗原后，DCs表面均可见细胞特异性CD80、HLA-DR、CD83和CD86分子的阳性表达，且表达水平无明显差异，说明两种方法对DC特异性共刺激分子及MHC表型分子的表达无显著影响。

本实验研究中，我们将DC-M iaPaCa-2融合细胞、DC-M iaPaCa-2 RNA转染细胞及Mock-DC与自体T细胞混合培养，结果显示在不同效靶比情况下，不同实验组DCs均能刺激自体T细胞增殖。但DC-M iaPaCa-2 RNA转染细胞对自体T细胞的增殖刺激能力显著高于DC-M iaPaCa-2融合细胞和Mock-DC，提示随着负载抗原效率的增加，DC刺激自体T细胞增殖的能力可显著增强。DC肿瘤疫苗的最终目的在于其诱导体内CTL反应，进而对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应。随着T细胞的增殖和特异性CTLs的扩增，活化的CTLs可分泌大量Th1型细胞因子，如IL-12、TNF-α和IFN-γ等，同时减少Th2型细胞因子，如IL10等的释放，使得免疫反应本身向着有利于肿瘤细胞杀伤的Th1反应为主的方向发展。因此，DCs对体外CTL的刺激活化能力可间接使用IFN-γ等细胞因子的释放量表示[11]。本研究发现，DC-M iaPaCa-2融合细胞与M iaPaCa-2总RNA转染DCs均具有体外激发抗原特异性CTLs的能力，但DC-M iaPaCa-2 RNA可表现出更强的CTL激发效应。此发现与Van Tendeloo等[14]的研究结果类似。提示胰腺癌细胞总RNA转染DC法的抗原负载效率更强，其体外活化、激发抗原特异性CTLs的能力亦更强。

综上所述，本研究结果表明人胰腺癌细胞总RNA转染DC可表现出较胰腺癌-DC融合细胞更强的促进抗原特异性CTLs增殖和活化能力，此结果为临床选择更加有效的胰腺癌DC肿瘤疫苗构建方式奠定了前期实验基础。

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Com parison of cytotoxic T lymphocyte induction by dendritic cells transfected with totalpancreatic can-cer RNA and fusion hybrided w ith tumor cell in vitro

CHEN Jiang,LIHong-Yu,WANG Di,XUWen-Da, GUO Xiao-Zhong．Departmentof Gastroenterology,Shenyang GeneralHospital of People Liberation Army, Shenyang 110016,China.Corresponding author:GUO Xiao-Zhong,Email:Guoxiaozhong1962@aliyun.com

ObjectiveTo compare theability of specific cytotoxic T lymphocytes(CTL)induction stimulated by dendritic cells(DC)transfectedw ith total RNA of human pancreatic cancer MiaPaCa-2 cell lines with DC fused with MiaPaCa-2 cell lines.MethodDCswere isolated and cultured from peripheral blood mononuclearcells(PBMCs).TotalRNA derived from MiaPaCa-2 cell lineswas transfected into DCsby electroporation.DCswere fused w ith M iaPaCa-2 cellsand the fusion efficiency wasassessed by flow cytometry (FCM).DC-MiaPaCa-2 hybridswere identified asPE-MUC1/FITC-CD86 double positive cells.The survival rate of DC wasdeterm ined by MTTmethod.The lymphocyte proliferation ability was evaluated bymixed cell culturemethod.The cytokines releasing of antigen-specific CTLsweremeasured by ELISA assay.ResultsDC-MiaPaCa-2 hybridswhich possessed both the phenotype of DC and MUC1 protein.The co-expression rate of both CD 86 and MUC1 positivity was（42.3±7.30）%.The survival rate of DCs transected w ith M ia-PaCa-2 total RNA were stabilized around 85%and the survival rate of DCs fused with MiaPaCa-2 cellswas 62.81%at96 hours(P＜0.05).The autologous T cell proliferation index of the total RNA of M iaPaCa-2 celllines transfection DC group was8432±611.25,significantly higher than the DC-M iaPaCa-2 hybrids5672± 107.51(P＜0.05);The secretion of IL-12p70,IL-10 and IFN-γlevels of the total RNA of MiaPaCa-2 cell lines transfection DC-specific CTL w ere significantly differentw ith DC-M iaPaCa-2 hybrids(P＜0.05).ConclusionDCs transfected with the total RNA of pancreatic cancer cells had a stronger ability to stimulate specific CTL in vitro than the DCs fusedwith pancreatic cancer cells.

Dendritic cells;RNA transfection;Cell fusion;Pancreatic cancer;Cytotoxic T lym phocytes

2016-09-19）

（本文编辑：乔伟光）

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.05.006

110016沈阳军区总医院消化科

郭晓钟，E-mail：Guoxiaozhong1962@aliyun.com

国家自然科学基金（81071982）