裂殖壶菌不同破壁方法的研究

赵书林，蔡双山，夏木阳，夏德才，胡 锐，杨齐华,闵征桥，张 念

(湖北福星生物科技有限公司，湖北 孝感 432100)

生物工程

裂殖壶菌不同破壁方法的研究

赵书林，蔡双山，夏木阳，夏德才，胡 锐，杨齐华,闵征桥，张 念

(湖北福星生物科技有限公司，湖北 孝感 432100)

裂殖壶菌细胞结构紧密，对其进行破壁是二十二碳六烯酸(DHA)高强度发酵的重点工序。以裂殖壶菌为实验菌种，比较了水洗法、膜过滤法、高压均质法、酶解法和膜过滤高压均质法5种破壁方法，观察了每种方法破壁前后细胞形态特征，同时测定细胞破壁率、发酵液含油量、DHA产量和DHA含量。结果表明：膜过滤高压均质法效果最为理想，破壁率达到100%；膜过滤高压均质法的含油量、DHA产量、DHA含量均为最高，分别达到16.98 g/L、7.08 g/L、41.71%；从生产的连续性和有效性来讲，膜过滤高压均质法是最佳的破壁方法。

裂殖壶菌；破壁；DHA

裂殖壶菌是海洋微藻的一种，在裂殖壶菌藻细胞油脂中，二十二碳六烯酸(DHA)含量高达35%～50%[1-2]，利用裂殖壶菌高密度发酵生产富含DHA的油脂，具有很大的经济效益和社会效益[3]。裂殖壶菌的脂质主要存在于由细胞壁包裹的裂殖壶菌菌体细胞内，很难分离出来。微藻的细胞壁很难破碎，导致DHA油脂的提取率不高[4-5]。因此，理想的破壁方法是DHA高强度发酵的关键。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

裂殖壶菌(Schizochytrium)，来自湖北福星生物科技有限公司。培养基均为常用的培养基。

碱性蛋白酶(酶活20万U/g)，正己烷、无水乙醇、氯化钠等均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

Agilent 7890A气相色谱仪，电子显微镜，XSP-BM-2CA生物显微镜，SPX-150C 恒温恒湿箱，SW-CJ-1F单人双面净化工作台，LDZX-75KB 立式蒸汽灭菌器，RE-52C 旋转蒸发器，JZH-50 均质机，陶瓷膜过滤器。

1.2 实验方法

1.2.1 裂殖壶菌的富集和培养

从平板中挑选裂殖壶菌单菌落到摇瓶中进行一级种子培养，摇床培养温度为28℃，转速为200 r/min；培养3 d后以10%的接种量进入二级种子培养，摇床培养温度为28℃，转速为200 r/min； 培养3 d后以5%的接种量进入100 L发酵罐进行培养，罐压0.03 MPa，通气量8 m3/h，搅拌速度40 r/min，发酵7 d后收获菌体[6]。

1.2.2 破壁方法

1.2.2.1 水洗法

取1 L发酵液，5 000 r/min离心5 min收集下层菌体，经3次水洗离心后提取油脂。

1.2.2.2 膜过滤法

取1 L发酵液，首先经1.2 μm陶瓷膜循环过滤水洗，其次经0.3 μm陶瓷膜循环过滤水洗，最后提取油脂。

1.2.2.3 高压均质法

取1 L发酵液，5 000 r/min离心5 min得到发酵浓缩液，经高压均质机均质(均质压力40 MPa)2次后提取油脂[7]。

1.2.2.4 酶解法

取1 L发酵液，5 000 r/min离心5 min得到发酵浓缩液，经碱性蛋白酶酶解破壁(酶解温度60℃，pH 8.0，酶解时间8 h)，然后提取油脂[8-9]。

1.2.2.5 膜过滤高压均质法

取1 L发酵液，首先经1.2 μm陶瓷膜循环过滤水洗，其次经0.3 μm陶瓷膜循环过滤水洗，最后经高压均质机均质(均质压力40 MPa)1次后提取油脂。

1.2.3 破壁率计算

用显微镜观察细胞破壁前后的发酵液，用血球计数板计数破壁前后的完整细胞数[10]。

式中：X为破壁率；N为破壁前的完整细胞数；N0为破壁后的完整细胞数。

1.2.4DHA油脂提取方法

取不同方法破壁的菌液，首先按1∶1的体积加入无水乙醇，振荡15min离心分离除去上清液水-乙醇相；其次按1∶1的体积向底层菌泥加入正己烷，振荡15min离心收集上清液，反复3次直到上清液无色透明，最后60℃旋转蒸发收集DHA油脂，测定含油量、DHA含量和产量[9,11-12]。

1.2.5 扫描电镜观察细胞形态

分别选取破壁前后的菌液，真空冷冻干燥24h，用牙签挑取少量菌丝置于观察盒上喷金，在扫描电镜下观察其细胞形态特征[13]。

2 结果与讨论

2.1 不同破壁方法的破壁率比较

用平板计数法计数细胞破壁前后的完整细胞数，计算破壁率，结果见图1。

图1 不同破壁方法的破壁率比较

破壁率间接反映细胞的出油率，破壁率越高，出油率越高，反之相反[14]。从图1可以看出，膜过滤高压均质法破壁率最高，达100%，其次为酶解法和高压均质法，分别为98%和89%，膜过滤法和水洗法效果一般，分别为60%和38%。

2.2 破壁前后细胞形态的比较

为分析不同破壁方法对细胞形态的影响，使用扫描电镜观察破壁前后的细胞形态，结果见图2[15-16]。

从图2可以看出，破壁前裂殖壶菌细胞表面粗糙有褶皱，直径在15μm左右，细胞形态为卵形[17]。水洗法破壁后的细胞表面光滑，无细胞内容物质渗出，细胞结构完整；膜过滤法破壁后的细胞表面更加光滑，无细胞内容物质渗出，但细胞壁出现裂痕，如果稍加外力作用细胞壁便会完全裂开，可达到破壁效果；高压均质法破壁后的细胞破裂比较严重，有少量内容物质渗出在细胞表面，细胞形态为卵形；酶解法破壁后的细胞破裂最为严重，细胞内容物质大量渗出，细胞形态呈不规则形态；膜过滤高压均质法破壁后的细胞破裂比较严重，未破裂的细胞壁出现裂痕，少量细胞内容物质渗出，但细胞表面光滑，细胞形态为卵形。

2.3 不同破壁方法效果分析

不同破壁方法的含油量、DHA产量和DHA含量见表1。

图2 破壁前后细胞形态的比较 表1 不同破壁方法的含油量、DHA产量和DHA含量

项目水洗法膜过滤法高压均质法酶解法膜过滤高压均质法含油量/(g/L)6．8510．2914．8816．1416．98DHA产量/(g/L)2．744．126．086．657．08DHA含量/%39．9940．0140．8841．1841．71

从表1可以看出，5种破壁方法收集的油脂DHA含量相差不大，水洗法收集的油脂DHA含量最低，为39.99%，膜过滤高压均质法收集的油脂DHA含量最高，达到41.71%。

由于破壁效果不同，导致含油量相差甚大。水洗法细胞损失较大，破壁率为38%，收集的油脂基本无腥味，含油量为6.85 g/L；膜过滤法可以去除发酵液中水溶性杂质以及小分子多糖、含氮等物质，收集的油脂基本无腥味，破壁率为60%，含油量为10.29 g/L；高压均质法在40 MPa的压力下均质2次，破壁率为89%，收集的油脂略有短暂腥味，含油量为14.88 g/L；酶解法破壁率为98%，但是酶解时间长，酶本身也带有异味，实际生产中油脂很容易变质，特别是夏天，收集的油脂腥味很重，滞留时间很长，含油量为16.14 g/L；膜过滤高压均质法破壁率为100%，经过膜过滤的发酵液只需在40 MPa的压力下均质1次，油脂无腥味，含油量最高，达到16.98 g/L。

目前国内外不少学者对裂殖壶菌的发酵工艺进行了研究，Hibbeln等[18]对SchizochytriumBL10培养168 h后采用均质法破壁收集的油脂DHA含量和含油量达到38.9%和14.40 g/L，而本研究中膜过滤高压均质法收集的油脂DHA含量和含油量达到41.71%和16.98 g/L。

3 结 论

(1)从破壁前后的细胞形态可以看出，水洗法破壁和膜过滤法破壁很难使细胞破壁完全；酶解法破壁，细胞内容物质大量渗出，故收集的油脂腥味很重，滞留时间很长；然而膜过滤高压均质法破壁，细胞壁虽然破裂，但只有少量细胞内容物质渗出，故收集的油脂品质好、无腥味。

(2)从破壁率可以看出，酶解法和膜过滤高压均质法都可以满足破壁工艺要求，但是酶解法耗时长，收集的油脂品质差，所以从生产的连续性和有效性来讲，膜过滤高压均质法是最佳的破壁方法，因此膜过滤高压均质法完全可以适用DHA高强度的生产。

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Different wall-breaking methods ofSchizochytrium

ZHAOShulin，CAIShuangshan，XIAMuyang，XIADecai，HURui，YANGQihua，MINZhengqiao，ZHANGNian

(HubeiFuxingBiologicalTechnologyCo.，Ltd.，Xiaogan432100,Hubei,China)

Schizochytrium’s cell structure is tight, so wall-breaking is the key process of DHA high strength fermentation.WithSchizochytriumas experimental bacteria, the wall-breaking methods, including water-washing,membrane filtration, high pressure homogeneous, enzymolysis and high pressure homogeneous composite membrane filtration were compared, and the morphological characteristics of cells before and after wall-breaking by each method were observed, in the same time the cell wall-breaking rate, oil content of fermentation liquid, and productivity and content of DHA were determined. The results showed that the effect of high pressure homogeneous composite membrane filtration method was the best with wall-breaking rate 100%, also the oil content of fermentation liquid, and productivity and content of DHA of that method were the highest, reaching 16.98,7.08 g/L and 41.71%,respectively. So high pressure homogeneous composite membrane filtration method was the best way to break the wall from the aspect of continuity and efficiency of production.

Schizochytrium; wall-breaking; DHA

2016-05-13；

2016-10-24

国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2014AA021702)

赵书林(1989)，男，工程师，硕士，主要从事微生物油脂的研究(E-mail)396858346@qq.com。

TS218;TQ92

A

1003-7969(2017)01-0109-04