经典Wnt/β-catenin信号通路抑制因子NKD1在肿瘤中的表达

赵丽楠 王洪武 夏海波 王翠英 綦会霞 张俊毅 王玉敏

(赤峰学院医学院附属医院中心实验室,内蒙古 赤峰 024005)

经典Wnt/β-catenin信号通路抑制因子NKD1在肿瘤中的表达

赵丽楠 王洪武1夏海波2王翠英3綦会霞3张俊毅4王玉敏3

(赤峰学院医学院附属医院中心实验室,内蒙古 赤峰 024005)

NKD1;Wnt/β-catenin信号通路

裸角质膜同源蛋白(dNKD)最早是在果蝇体内发现的，其基因突变是引起果蝇分节运动缺失的主要诱因〔1〕。随后，dNKD的两个同系物NKD1及NKD2在哺乳动物体内被发现〔2〕，二者分别位于人染色体16q12.1和5p15.3，具有43.8%的高度同源性。NKD1的生物学作用使其可以参与经典Wnt/β-catenin 信号通路，从而影响肿瘤的发生发展和转归，另外，它还是评估肿瘤患者预后的辅助指标之一。

1 NKD1 的分子特征和组织表达特异性

Wnt信号通路是体内重要的信号通路之一，在多细胞生物体轴分化过程中承担着非常重要的作用，还参与大脑及脊椎动物的肢体起始和顶端外胚层脊的形成，调控干细胞的生长发育。研究显示，许多肿瘤的发生发展都与Wnt信号通路异常表达有关〔3〕。研究〔4,5〕认为NKD1是Wnt通路的拮抗剂，广泛表达于多种正常组织中，NKD1在胞质中通过其EF手型结构域(EF-Hand)与蓬乱蛋白(Dvl)的盘状同源区域(PDZ)区域结合后，阻滞经典Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，并通过活化c-Jun氨基末端激酶(c-JNK)基因调控上皮细胞的极性，间接抑制肿瘤的发生。

2 NKD1与Wnt/β-catenin信号通路的关系

研究〔6〕证实，许多肿瘤的发生发展都涉及Wnt通路。Wnt信号在细胞内有两条通路〔7〕，即经典Wnt/β-catenin通路和非经典Wnt/β-catenin通路。在经典Wnt/β-catenin通路中，配体分子Wnt 与七次跨膜受体(Fz) 和其辅助受体低密度脂蛋白相关受体(LRP)5/6结合。Wnt-Fz-LRP6复合体募集支架蛋白(Axin)和Dvl，引起LRP6磷酸化，然后将Axin聚集到受体复合体，阻止Axin介导的β-catenin的磷酸化，稳定β-catenin活性，使β-catenin聚集在胞质内并进入细胞核，结合转录因子T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)形成复合体，激活受Wnt通路调控的一些目标基因的表达〔8〕。当Wnt不存在时，β-catenin会与抑癌基因(APC)、Axin、酪蛋白激酶(CK)1和糖原合成酶激酶(GSK)3 形成复合体，然后被CK1 和GSK3相继磷酸化。磷酸化的β-catenin被E3泛素连接酶识别β-转导重复相溶蛋白(Trcp)并降解，进而TCF-LEF/Groucho和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制受Wnt调控的靶基因表达〔9〕。非经典Wnt/β-catenin有两条细胞内途径：①平面细胞极性通路(PCP)，在PCP通路中，Fz与配体结合后，通过Dvl将信号传导至小分子G蛋白Rac和Rho，激活下游靶基因，通过调控肌动蛋白的活性影响细胞骨架重新排列。②Wnt/Ca2+通路，Wnt信号能够通过Dvl、Fz和G-蛋白的传导，释放细胞内的Ca2+，Ca2+可以提高蛋白激酶(PK)C、磷酸酶(PL)C和钙调蛋白激酶(CamK)2等酶的活性，影响细胞的生物学功能。这两条途径在细胞的增殖与分化、神经发育及体轴形成等生物学过程中起至关重要的作用。Dvl是Wnt信号通路上游的一个效应分子，是PCP通路、经典Wnt/β-catenin通路及Wnt/Ca2+通路的重要调控因子。一些能够与Dvl结合的蛋白可以改变Dvl的蛋白水平，这其中就有NKD1蛋白。研究表明，NKD1 对存在于细胞不同部位的β-catenin有着不同的作用，如NKD1是细胞质中β-catenin蛋白的下游调节因子，主要维持稳定β-catenin蛋白的水平，阻止β-catenin向胞核聚集;而细胞核内的β-catenin，NKD1是其上游调控基因，对β-catenin的核内累积有着负调控作用。

NKD1在细胞质中可以通过其EF-Hand与Dvl的PDZ结构域相结合后，作为Wnt/β-catenin通路的负调控因子发挥作用〔4,5,10,11〕，抑制Wnt/β-catenin信号通路的功能。NKD1可作为引导开关，使Dvl由Wnt/β-catenin通路向JNK/PCP通路转化，进而抑制经典通路。Wnt途径控制脊椎动物细胞极性及细胞迁移，可被用来辨别瘤形成情况，因此Wnt途径的抑制物NKD1同样能够调节肿瘤的形成和发展，具有重要意义。

3 NKD1在各种肿瘤中的表达和作用

关于 NKD1 与肿瘤的关系鲜有报道，目前的研究〔3〕证明，NKD1在胃癌、直肠腺瘤、结直肠癌及乳腺癌中的蛋白表达水平是下降的，而且它的表达水平与肿瘤的分化程度、转移及预后有关。其他研究〔6〕显示，在肝母细胞瘤和直肠癌中NKD1的mRNA水平是上升的，奇怪的是，在非小细胞肺癌(NSCLC)中却存在NKD1 mRNA 高表达而蛋白低表达的现象，且造成该蛋白低表达的原因与临床病理因素有密切的关系。即NKD1在不同来源的肿瘤中其蛋白及mRNA的表达情况尚存在较大争议〔12,13〕。

3.1 NKD1在结直肠癌中的表达 消化道肿瘤的发生与Wnt信号通路的异常激活有着密不可分的关系。统计表明，90%以上的人类结直肠癌中都存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活及胞内β-catenin的累积[14，15]。因此，作为Wnt通路中最关键的因素之一，NKD1受到越来越多研究者们的重视。

免疫组化检测显示，结直肠癌患者术后癌症组织中NKD1表达的阳性率明显低于正常组织，NKD1的表达水平还和肿瘤的杜克(Dukes)分期、淋巴结转移及细胞增殖抗原标记物(Ki67)的表达有关，生存分析显示若NKD1表达水平较低，则患者的预后较差。因此，结直肠癌中NKD1的表达水平对疾病的发生发展起着关键作用，其表达水平的高低可能对判断患者预后会有一定的价值〔14〕。最近研究表明，NKD1 在正常组织中的阳性率明显高于结直肠腺瘤、结直肠癌，其表达水平与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及Dukes分期密切相关，差异有统计学意义〔15〕。研究证明，结直肠肿瘤中β-catenin的蛋白表达水平下降是由NKD1所调控的〔5〕。Guo等〔16〕通过对NKD1缺陷的结直肠癌细胞进行研究，发现NKD1的缺失能加强细胞中β-catenin的稳定性且促进细胞增殖，这暗示着NKD1可能在对β-catenin的调控上发挥作用，即Wnt信号通路的负反馈调节是通过NKD1对β-catenin核聚集的负向调控来完成的。因此，NKD1可能与结直肠癌的发生发展密切相关。同时，联合检测β-catenin和NKD1的表达水平，可能为结直肠肿瘤的临床诊断及预后评估提供一定帮助。

3.2 NKD1在肺癌中的表达 NKD1在不同来源的肿瘤中的表达尚存在较大争议，在同一来源的肿瘤中其蛋白及mRNA的表达也存在不同情况。在NSCLC中NKD1蛋白的表达量远远低于癌旁肺组织，但mRNA的表达却显著高于癌旁肺组织，这个结果与已经证实的在不同来源肿瘤中表达的报道相同，但同时也显示即使在相同肿瘤中，NKD1的蛋白水平与mRNA表达水平也可能不同〔17〕。其原因可能由于NKD1蛋白表达下调，导致其失去了对Wnt信号通路活性的抑制作用，所以在肺癌组织中，NKD1蛋白表达水平明显低于周边肺组织，但其mRNA水平为什么高于周围正常肺组织呢，有报道认为NKD1本身也是经典Wnt信号通路的下游靶基因之一〔18〕，其mRNA表达上升，可能与肺癌组织中Wnt信号通路的高度激活状态相关，经典Wnt通路的高活性，可以使NKD1转录活性增强，导致mRNA出现高度表达状态。然而mRNA高表达，其蛋白水平却又明显下降，这可能与翻译后修饰及NKD1蛋白的降解增强有关。Yan等〔5〕则认为，在生物体内存在着调节NKD1表达的一种负反馈机制，因此如果NKD1蛋白高表达，Wnt信号通路的活性就会受到抑制，于是NKD1的转录活性下调;然而如果NKD1蛋白表达下降，Wnt信号通路的活性就会增加，进而加快了NKD1的转录及翻译，导致NKD1的mRNA水平上升。但目前只是推测，具体的原因和生物学机制还需要更深入的研究。赵月等〔17〕研究表明在NSCLC里，NKD1的蛋白低表达与NSCLC的淋巴结转移、低分化、高肿瘤淋巴结转移(TNM)分期及不良预后等有密切关联。研究表明79%的NSCLC新鲜组织标本中NKD1的蛋白表达水平显著低于相应的癌旁正常肺组织，而 mRNA 表达水平则显然高于正常的肺组织。免疫组织化学数据显示在 78% 的 NSCLC标本中NKD1的表达明显低于正常肺组织〔19〕。这个发现虽然和已有的在不同来源肿瘤中存在表达的结果相一致，但也显示了在同一肿瘤中，NKD1的蛋白表达与mRNA的表达水平并不完全相同。其研究结果还证实在NSCLC 中腺癌NKD1 的表达高于鳞癌，与分化程度正相关，与淋巴结转移和 TNM 分期负相关，并且NKD1表达较低的患者术后生存时间明显低于正常表达者。总之，在 NSCLC 里NKD1的蛋白表达水平是下调的，而mRNA 的表达水平却是上调的，而且患者的临床病理因素和不良预后都与NKD1的蛋白水平下调程度有关。肺腺癌研究显示，40例肺腺癌中有8例NKD1的表达下调，15例NKD1正常表达，15 例NKD1高表达。而NKD1的低表达与淋巴结转移具有一定的关联性〔20〕，所以，NKD1可作为肺腺癌预后的标志因素。

3.3 NKD1在乳腺癌中的表达 陈巍等〔21〕用免疫组化方法检测了人乳腺癌细胞中β-catenin蛋白与NKD1的表达关系。其结果显示，对照组中NKD1和β-catenin蛋白的表达水平显著高于实验组，且实验组中NKD1和β-catenin蛋白的表达与肿瘤的临床分期、淋巴结转移、脉管浸润的表达关系密切;实验组中β-catenin和NKD1的表达正相关，生存分析结果显示β-catenin和NKD1表达水平较低的患者预后较差。表明这两种蛋白均与乳腺癌的发生发展有关联，也可以说二者在肿瘤的脉管散播过程有重要作用，Wnt/β-catenin通路可能是介导NKD1蛋白发挥其生物学作用的途径。或者是通过血管内皮生长因子的调控发挥作用。β-catenin和NKD1之间可能存在通路作用，参与了肿瘤细胞外细胞连接的改变，协同加快肿瘤的生长、侵袭及转移。由于肿瘤中NKD1的异常表达导致Wnt/β-catenin经典通路产生障碍，促使胞质内还没有被磷酸化降解的β-catenin进入细胞核内，结合TCF/LEF形成复合体，进而启动下游相应目标基因的转录，加快肿瘤的侵袭和转移。此机制可能与癌基因的作用有关，同时也是肿瘤生长转移过程中的生物学行为特征之一。乳腺癌中β-catenin蛋白和NKD1具有协同作用，二者的共同低表达加快了肿瘤的发生发展。

3.4 NKD1与骨肉瘤(OS)转移 OS是儿童和青少年易患的疾病，是临床上常见的原发性恶性骨肿瘤之一。其恶性程度较高、血行转移发生早、容易发生肺转移、病情发展快速且死亡率特别高，因此，精确地对OS做出早期诊断和有效抑制或者阻断OS的转移，已经成为治疗OS的重中之重。闫康〔22〕研究发现，Wnt 信号通路中的NKD1 在具有高转移性的OS细胞系 F5M2 中呈现高表达状态，提示NKD1 可能促进OS的转移。若改变OS细胞中miR-195 的表达水平可以相应改变NKD1 的表达量。研究显示，骨样骨瘤组织和骨软骨瘤组织中NKD1 蛋白表达阳性率显著低于OS组织;但是骨软骨瘤NKD1 蛋白表达阳性率与骨样骨瘤组织 NKD1 蛋白表达的阳性率无明显差异。同时，NKD1 的表达还与OS是否发生转移及患者 3 年生存率显著相关，而与年龄、性别、组织学分级、肿瘤发生部位、肿瘤大小及组织学分型等临床表型无明显相关性。

综上，肿瘤发生与NKD1表达具有重要关系，其发挥作用的途径主要依赖于Wnt信号传导通路，NKD1能抑制该通路的激活作用，抑制癌症发生。当NKD1表达水平下降时，Wnt信号通路被激活，引起β-catenin进入胞质及细胞核，促进肿瘤浸润及转移。因此，NKD1对β-catenin的调控有极为重要的作用，但是对于分布在细胞不同部位的β-catenin，NKD1对其有着不同的作用。同时，NKD1还与不同肿瘤的分期、转移及预后有关。总之，NKD1可作为临床上治疗肿瘤的作用靶点，具有一定的临床意义。

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〔2016-01-04修回〕

(编辑 苑云杰/王一涵)

国家自然科学基金项目(No.81260196)；国家社科基金项目(No.13CRK009);内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划(No.NJYT-13-B20)；内蒙古自治区高等学校科学研究项目(No.NJZZ12306，NJZZ14271)；内蒙古自然科学基金项目(No.2014MS0892,2014BS0814，2013MS1176)

1 乳腺外科 2 泌尿外科 3 肿瘤内科 4 病理科

王玉敏(1981-)，女，副教授，博士，硕士生导师，主要从事氧化损伤与疾病研究。

赵丽楠(1988-)，女，初级检验师，硕士，主要从事肿瘤机制研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1786-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.095