神经束路示踪技术在脊髓损伤与再生研究中的应用进展①

李琬悦，丁煜萌，王曦

神经束路示踪技术在脊髓损伤与再生研究中的应用进展①

李琬悦1，丁煜萌1，王曦2

脊髓损伤是神经科学领域重要的研究方向之一，而神经束路示踪技术是其重要的研究手段。脊髓中神经纤维性质复杂，在人类和动物间存在很多分布差异。本文对神经束路示踪技术、脊髓损伤易累及的主要神经纤维的分布特点和在种属间的差异及神经束路示踪技术在脊髓损伤与再生研究中的应用进行综述。

脊髓损伤；神经束路示踪技术；逆行示踪；顺行示踪；跨节示踪；综述

[本文著录格式]李琬悦，丁煜萌，王曦.神经束路示踪技术在脊髓损伤与再生研究中的应用进展[J].中国康复理论与实践, 2017,23(6):657-661.

CITED AS:Li WY,Ding YM,Wang X.Application of neural tract tracing techniques in study of spinal cord injury and regeneration (review)[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(6):657-661.

随着现代交通和建筑业的发展，脊髓损伤发生率显著增加。流行病学调查资料显示[1-2]，全世界有250万脊髓损伤患者。我国北京2002年脊髓损伤发生率为60/100万，与20世纪80年代末调查得到的6.8/100万的发病率相比显著增加[3]。脊髓损伤后轴突难以再生，其高致残率严重威胁人们的正常生活，是困扰广大医务人员和研究者的重大难题，因此成为重点关注的神经科学研究方向之一。对该难题的研究，离不开神经束路示踪技术这一重要的研究手段。

不论何种性质的神经纤维，损伤的神经纤维再生或从损伤区以外新生的轴突跨过损伤区与靶细胞重新建立功能联系是恢复脊髓功能的唯一途径。如果示踪剂能够通过轴浆运输跨过损伤区，说明有再生或从损伤区以外新生的轴突跨过损伤区。由于大部分神经纤维束路缺乏特异的免疫标记，所以，神经束路示踪技术可以称作研究轴突再生、判断神经元解剖结构是否完整和功能关系是否建立的金标准[4-5]。

脊髓内神经纤维性质复杂，脊髓损伤后，脊髓灰质和白质都会受到不同程度的损伤。受损成分既会有运动性的，又会有感觉性的；既有大脑来源的，又有脊髓来源的；既有大脑皮层来源的，又有皮层下中枢来源的，这就使研究变得复杂。弄清脊髓内神经纤维的分布特点，无疑对脊髓损伤的修复和再生研究具有重要意义。实验动物是用来研究脊髓损伤的重要实验对象，但是在它们的脊髓中，神经纤维的分布和性质与人类又有所不同，只有充分了解这些不同之处，才能更有效地利用示踪技术在实验动物模型中进行研究，造福人类的医学研究事业。

脊髓损伤后，我们需要根据研究目的和神经纤维解剖特点，来选择合适的示踪方法进行研究。本文将对常用的神经束路示踪方法、脊髓损伤易于累及的主要神经纤维特点和在人与动物中的不同分布，以及示踪技术在其研究中的应用加以综述。

1 常用示踪技术

目前神经束路示踪技术常常被分为四代[6-8]。第一代是最传统的染色方法，如Nissl法、Nauta法，需要损伤神经，通过银染变性的神经纤维来进行束路示踪[9-10]，揭示核团之间的联系等，这类方法不能在活体动物上进行，故应用受到很大限制。第二代和第三代神经束路示踪技术主要利用轴浆运输的原理得以实现，示踪剂被神经元摄取后，根据轴浆流的方向，分为顺行示踪和逆行示踪。其中第二代是利用逆行追踪剂示踪，如辣根过氧化物酶(horseradishper oxidase,HRP)、霍乱毒素B亚单位(choleratoxin subunit B,CTB)和多种荧光素等，注射到神经纤维周围被神经末梢或轴突吸收后，逆轴浆流运输到神经元胞体。第三代是利用顺行追踪剂示踪，如HRP、生物素化葡聚糖胺(biotin dextran amines,BDA)和植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)等，注射到神经元胞体周围，被神经元胞体吸收后，顺轴浆流主动运输到神经末梢。第四代是利用转基因动物在特定神经细胞中表达荧光蛋白来实现。第二代和第三代方法目前仍然是脊髓损伤实验研究中的主要研究方法，其中一些示踪剂还可以被荧光标记或本身可以发出荧光，便于用荧光显微镜直接观察。下面着重对目前在脊髓损伤与再生研究中最常用的逆行示踪和顺行示踪进行综述，并简要介绍第四代技术在脊髓损伤实验中的应用。

1.1 逆行示踪(retrograde tracing)

逆行示踪剂是一类易于被损伤的神经元轴突或纤维末梢吸收，经过神经纤维运输到达胞体，从而观察神经元形态、性质的一类物质。在轴突损伤与再生实验中可以注射于损伤处远端神经纤维周围，通过观察统计脊髓、脑干、皮质等胞体所在部位被逆行标记的神经元胞体，相对评估神经纤维再生情况。

HRP是从辣根中提取的一组同工酶的混合物，SigmaⅣ型HRP的80%以上为C同工酶，故常用于追踪，且效果良好。HRP在20世纪70年代初开始被用作逆行示踪剂[6,11]，后来发现HRP也可以被神经元胞体摄入，顺行运输至末梢部位，还可以跨过外周神经节运输，故后来也被用作顺行示踪剂和跨节示踪剂。

荧光金(fluoro gold,FG)是目前脊髓损伤研究中常用的逆行示踪剂，它标记的神经元不容易脱色，在活体动物中可以存在一年的时间[5]。将其注射于损伤部位以下，动物存活一段时间后，在脊髓、脑干、间脑和端脑等关注的部位切片，观察标记的神经纤维和胞体，既可以在紫外线(323 nm)激发下直接用荧光显微镜观察是否有金黄色荧光的阳性成分，也可以用抗荧光金的抗体免疫组化染色后观察。

另外固蓝(fast blue,FB)和双咪基黄(diamidino yellow,DY)也是常用的逆行追踪剂，前者显示蓝色荧光标记的细胞核，后者显示黄色荧光标记的细胞质，可用于双标。不过荧光素染料普遍分子小，易于扩散，在特异性标记时注射剂量和部位必须控制好。羟化青(Dil)也被广泛用于逆行和顺行示踪，在549 nm激发光下可以产生发射波长为565 nm的红色荧光[11]。

Roozbehi等[12]分别对低龄(40日龄)、中龄(5～6月龄)和高龄(28～29月龄)的大鼠进行同等程度的脊髓L1平面横断，并在L4平面注射逆行示踪剂，结果显示，在损伤后第8周，低龄和中龄鼠后肢运动功能评分(BBB评分)要明显高于高龄鼠；在损伤后第10周时，Dil逆行示踪发现低龄鼠有较多的再生神经纤维穿过脊髓损伤区域。

CTB也是一种非常灵敏的示踪剂，既可用于逆行示踪[13]，也可用于顺行示踪[14]，还可以用于跨节示踪[15]。B亚单位为霍乱毒素与细胞受体结合的亚单位，无毒性。标记结果的可视化可以用抗CBT的抗体染色，通过免疫组织化学方法显示出来；也可以用荧光素标记CTB，在荧光显微镜下直接观察。CTB常常与HRP交联，形成CTB-HRP复合物，极大提高了作为示踪剂的灵敏度[15]。

1.2 顺行示踪(anterograde tracing)

顺行示踪剂是一类被神经元胞体吸收，经过轴浆运输到达轴突末梢，从而观察纤维形态、性质的一类物质。在轴突损伤与再生研究中，常会注射于神经元胞体集中处，一般是某类特定纤维的起点，如大脑运动皮质、中脑红核等，通过观察示踪剂在远端神经纤维处的显现，来研究这一类特定纤维轴突的再生情况。

BDA是最常用的顺行示踪剂[6]。Bayless等[16]通过注射BDA到成年大鼠眶前额皮质，利用其顺行示踪原理，观察背侧纹状体内BDA阳性神经纤维投射，发现雌性大鼠BDA阳性投射纤维显著高于雄性，从而认为在抑制性控制水平，存在性别的神经解剖学差异。值得注意的是BDA有分子量为3000和10,000两种分子形式，BDA(10,000)标记轴突和神经终末清楚准确，用于顺行示踪；而BDA(3000)只能标记神经元胞体，不能用于顺行示踪[17]。BDA可视化可以通过直接结合荧光素标记的卵白素或抗生物素抗体，在荧光显微镜下观察；也可以用DAB方法染色，放大标记效果，制作保存时间长久的切片。CTB和HRP等也可用于顺行示踪。

1.3 跨节示踪(transganglionic tracing)

将示踪剂注射于周围神经感觉末梢或感觉神经干后，示踪剂可以跨越外周神经节被传送到其中枢突的末梢，这类示踪剂称为跨节示踪剂。

CTB和麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)是常用的跨节示踪剂，常常与HRP交联使用，提高其灵敏性。它们可以注射于坐骨神经，经轴浆运输逆行至背根神经节后，又沿中枢突进入脊髓，继续沿脊髓背侧索上行至薄束核，通过在薄束核观察是否有示踪剂阳性神经纤维来判断轴突的完整性[15]。生物素化的CTB(b-CTB)可以极大地提高CTB的摄取、转运和敏感性，被证实也可以用于跨节示踪[18]。

1.4 新技术的突破——转基因动物的应用

随着转基因技术的高速发展，研究者可以使用在特定神经细胞中表达荧光蛋白的转基因动物来研究脊髓损伤后轴突的修复与再生[19]，目前较多用于对皮质脊髓束再生的研究。Bareyre等[20]利用仅在皮质脊髓束表达黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)的双转基因小鼠，观察皮质脊髓束的腹侧束和背外侧束与运动神经元间的联系，并在完全切断背侧束后观察腹侧束和背外侧束与神经元之间联系程度的变化。这种技术手段相比于前三代示踪方法，不需要损伤实验动物，标记的神经束路更准确，能进行动态观察，这一系列优点使得它具有广阔的应用前景。但是Willenberg等[21]发现CST-YFP转基因鼠的一部分表达YFP的神经轴突并非来自于皮质脊髓束，在网状脊髓束、红核脊髓束也发现YFP的表达，结合3D成像技术他们进一步证明这种转基因鼠YFP基因的表达并不具有神经束路特异性，在脊髓损伤后再生的研究工作中起到的作用也是有限的。这说明转基因动物模型的应用有待进一步研究。

2 脊髓损伤易累及的主要纤维及其在种属间的不同分布

脊髓是外周神经与高级神经中枢相联系的中继站。脊髓白质中分布有上行传导纤维即感觉纤维、下行传导纤维即运动纤维以及中间神经元及其轴突，在脊髓损伤时，都会受到不同程度的损伤。

2.1 运动纤维

2.1.1 皮质脊髓束(corticospinal tract)

皮质脊髓束是哺乳动物脊髓内最长的下行运动传导束。皮质脊髓束支配相应骨骼肌的随意运动，特别是前肢或手的精细运动，是脊髓中极其重要的一类传导束。神经束路示踪技术在这类纤维的损伤和再生研究中发挥着重要作用。

皮质脊髓束纤维主要起源于感觉运动皮层第Ⅴ层，也有一部分纤维来自皮质其余部分。值得注意的是，它在不同哺乳类动物脊髓白质中的分布有所不同。在灵长类动物和人，绝大多数皮质脊髓束纤维自对侧大脑皮质发出，经锥体交叉，行走于脊髓白质外侧，少数纤维不经锥体交叉，行走于同侧脊髓白质腹外侧和腹侧。比如在恒河猴，皮质脊髓侧束占大约87%，而皮质脊髓腹外侧束和腹侧束大约只占11%和2%[22]；在人类，皮质脊髓侧束占大约90%，而皮质脊髓前外侧束和前束分别占大约8%和2%[4]。而在啮齿类动物，背侧束是皮质脊髓束的主要成分，自对侧大脑皮质发出，经锥体交叉后下行于脊髓白质背侧索腹侧；背外侧束自大脑对侧皮质发出，行走于脊髓白质外侧索；腹侧束自大脑同侧皮质发出，不经锥体交叉，行走于脊髓白质腹侧索。后两者只占总皮质脊髓束纤维的很少比例，Bareyre等[20]观察到小鼠脊髓胸段背侧索的腹侧有4800根左右皮质脊髓束纤维，外侧索有190根左右皮质脊髓束纤维，腹侧索有92根左右皮质脊髓束纤维。但是根据Weidner等[23]和Bareyre等[20]的实验结果，占少数的腹侧束和背外侧束在背侧束受损时可能发挥重要的代偿作用。Rosenzweig等[22]利用BDA顺行示踪技术证实，恒河猴皮质脊髓束比大鼠具有更广泛的双侧脊髓投射，推测提高这些广泛的双侧投射的皮质脊髓束纤维的发芽，或许能为脊髓损伤后的恢复提供新的治疗靶点。皮质脊髓束在不同动物之间的不同分布需引起实验人员的注意。

在脊髓损伤的实验动物模型，可以利用顺行示踪原理，将示踪剂注射于感觉运动皮层，在损伤远侧端观察是否有神经纤维跨过损伤区进入远侧端；或者利用逆行示踪原理，将示踪剂注射于损伤区远侧端后，在近侧端胞体所在部位即感觉运动皮层观察示踪剂存在情况，以此研究判断皮质脊髓束的修复和再生情况。

近年来关于皮质脊髓束轴突的修复和再生有大量研究，利用神经束路示踪技术，在许多动物模型证实了成年动物轴突损伤后再生的能力。Danilov等[24]研究发现，C4脊髓损伤成年小鼠敲除感觉运动皮层内神经元的同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)，有利于前肢运动功能的恢复。他们将BDA注射到感觉运动皮质进行顺行追踪，发现在PTEN敲除鼠损伤脊髓的尾侧端有更多的BDA标记的轴突，同时其前肢运动功能的恢复也较对照组显著，提示PTEN敲除促进皮质脊髓束的再生和功能恢复。也有许多研究人员将成年恒河猴作为研究对象，证实在脊髓损伤后，皮质脊髓束神经纤维可以再生[25-27]。例如Nakagawa等[27]应用BDA示踪技术对成年恒河猴脊髓损伤区域以下的皮质脊髓束纤维的重建进行研究，他们在成年恒河猴脊髓的C7到C8节段之间造成半切损伤，通过顺行示踪技术，发现皮质脊髓束的神经纤维发生重建，新生的神经元优先长入脊髓直接控制运动功能的区域，与此同时恒河猴上肢精细运动功能也逐渐恢复。

2.1.2 红核脊髓束(rubrospinal tract)

红核脊髓束起源于中脑红核，交叉至对侧，走行在脊髓外侧索，主要调节运动功能。红核脊髓束在不同动物分布有所不同。在灵长类动物和人，其分布在背外侧索内侧，与皮质脊髓侧束有重叠，轴突主要位于颈膨大和腰膨大[28]；在啮齿类动物，红核脊髓束起源于红核大细胞部，跨过中线，分布在脊髓外侧索背侧缘[29]。尽管尚无定论，但是普遍认为人类和其他灵长类动物的红核脊髓束已经退化[2]，皮质脊髓束取代了红核脊髓束对运动的控制作用[30]。

因为红核脊髓束在脑干和脊髓部分分布集中，容易被特异标记，示踪剂便于被注射和观察；同时，通过损毁啮齿类动物的脊髓外侧索，可以全横断红核脊髓束，因此，红核脊髓束成为研究运动神经元轴突再生的一个很具吸引力的模型系统[4]。很多学者采用红核脊髓束研究脊髓损伤后轴突的再生，Mestre等[31]对不同种系的实验大鼠进行T9脊髓损伤后，逆行示踪红核脊髓束并观察其再生情况，结合BBB运动功能评分发现脊髓再生能力在Lewis大鼠明显低于Sprague-Dawley大鼠和Fisher 344大鼠。

2.1.3 网状脊髓束(reticulospinal tract)

网状脊髓束起源于脑干网状核，神经纤维分布于脊髓腹侧和腹外侧广大区域。网状脊髓束能激活脊髓运动神经元群而参与躯体运动和姿势的维持。在较为低等的脊椎动物，由于没有大脑皮层，网状脊髓束便成为主要的运动通路。

因为网状脊髓束与经过脑干的其他束路广泛重叠，所以顺行标记网状脊髓束会同时标记上脑干的前庭脊髓束和蓝斑脊髓束等；逆行标记时，也会标记到其他束路，故网状脊髓束不易于做特异束路的研究[4]。

Weishaupt等[32]研究发现，损伤大鼠皮质脊髓背侧束和红核脊髓束而保留网状脊髓束，6周后大鼠行为学有明显恢复，然而束路示踪结果显示，皮质脊髓束和红核脊髓束并无明显再生，网状脊髓束很可能发挥了重要代偿作用，虽然作用机制还不明确，但是对该束路的研究不容忽视。Filli等[33]利用顺行示踪技术，发现网状脊髓束被切断后，会自发地再生出大量树枝状的神经纤维绕过损伤区域，伴随脊髓损伤后运动功能的恢复。

2.2 感觉纤维

感觉纤维分布集中在背侧索，容易特异性损伤。由于损伤不需要脊髓全横断，故损伤后动物存活率较高，而且可以明确阐述是否有中枢轴突的再生，所以是研究中枢感觉神经元再生的一个代表性模型。

传导精细触觉和本体觉的感觉纤维经脊髓背根节进入脊髓白质，主要分布在脊髓背侧索，上行到达脑干薄束核和楔束核后换元向更高级脑区上行。研究者可以通过在坐骨神经注射追踪剂CTB来观察薄束核中是否有示踪剂阳性的感觉纤维的轴突出现，以此判断损毁是否完全。在这种示踪方法中，示踪剂需经感觉神经元周围突即坐骨神经摄取后向中枢运输，跨过背根神经节(感觉神经元胞体所在部位)，被传递至位于脊髓的中枢突，所以被称为跨节示踪技术。背侧索损毁的完全性还可以通过注射逆行示踪剂到薄束核，然后观察背根节是否有示踪剂的出现[4]。

Bonner等[34]将神经前体细胞移植入脊髓C1段背侧索损伤部位，然后用荧光金从丘脑腹后外侧核逆行标记背侧柱感觉神经元，在坐骨神经处注射CTB跨节标记感觉纤维，发现荧光金逆行到达背侧柱神经元胞体，CTB标记的轴突再生进入移植物；结合免疫电镜和电生理技术，进一步证实移植的神经前体细胞产生的神经元与宿主感觉神经元轴突之间可以产生兴奋性的突触联系。Hoeber等[35]将人胚胎干细胞起源的神经前体细胞移植到脊髓背根撕裂处，并将CTB注射到坐骨神经进行逆行追踪，结合NF200免疫组化染色，发现CTB随着再生的宿主有髓感觉神经纤维可以跨神经节进入脊髓背根，达到脊髓背根深部；而IB4标记的无髓感觉神经纤维却不能跨节进入脊髓背角，从而证实胚胎干细胞起源的神经前体细胞支持有髓感觉神经纤维的再生。

3 总结与展望

由于脊髓结构的复杂性与脊髓损伤研究的艰巨性，神经束路示踪技术在未来的研究中仍将发挥着不可替代的作用。第二代和第三代束路示踪技术操作便于掌握，是脊髓损伤研究者常用的基本方法，为脊髓损伤的研究发挥了巨大作用。随着转基因技术的发展，我们希望能看到更多更好的转基因示踪动物模型能应用到脊髓损伤实验中。

实验动物是用来研究脊髓损伤的重要实验对象，但是它们的脊髓中神经纤维的分布与人类又有所不同，只有充分了解这些异同之处，才能更有效地利用示踪技术在实验动物模型中进行研究，造福人类的医学研究事业。

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Application of Neural Tract Tracing Techniques in Study of Spinal Cord Injury and Regeneration(review)

LI Wan-yue1,DING Yu-meng1,WANG Xi2
1.First Pragade of Undergraduates,Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi 710032,China;2.Department of Neurobiology and Collaborative Innovation Center for Brain Science,School of Basic Medicine,Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi 710032,China

WANG Xi.E-mail:wangzh@fmmu.edu.cn

Spinal cord injury is one of the important field of neuroscience,and neural tract tracing techniques are important research tools.The neural fiber types in the spinal cord are complex,and there are some difference in structures between human beings and animals. This article reviewed different types of neural fibers closely related with spinal cord injury and regeneration,the difference between human beings and animals,and the application of neural tract tracing techniques in the study of spinal cord injury and regeneration.

spinal cord injury;neural tract tracing technique;retrograde tracing;anterograde tracing;transganglionic tracing;review

R651.2

A

1006-9771(2017)06-0657-05

2016-10-18

2016-11-08)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.06.008

国家自然科学基金项目(No.81171156)。

1.第四军医大学学员一旅，陕西西安市710032；2.第四军医大学基础部神经生物学教研室暨脑科学协同创新中心，陕西西安市710032。作者简介：李琬悦(1994-)，女，汉族，四川沐川县人，本科生。通讯作者：王曦，女，博士，硕士研究生导师，主要研究方向：中枢神经系统损伤及修复。E-mail:wangzh@fmmu.edu.cn。