小鼠诺如病毒研究进展

赵 娜 ， 黄一鸣, ， 潘晶晶, ， 雍 慧, ， 曹福源 ， 张艳淑 ， 姚 林, ， 李 爽

(1.华北理工大学实验动物中心 ， 河北 唐山 063000； 2.华北理工大学公共卫生学院 ， 河北 唐山 063000)

小鼠诺如病毒(murinenorovirus，MNV)是一种引起免疫缺陷小鼠脑炎、脑膜炎、肝炎、肠炎和肺炎的传染性病原，与人类诺如病毒密切相关[1]。2003年该病毒从转导蛋白和转录激活因子1(STAT-1)以及重组体激活基因2(RAG-2)缺陷(RAG-2-/-/STAT-1-/-)小鼠中被首次发现[2]，之后美国、加拿大、日本等国的实验小鼠体内均监测到该病毒，并发现MNV是感染实验动物的重要病原体，几乎所有的实验小鼠对此病毒易感[3]。MNV能通过接种细胞进行培养，弥补了人类诺如病毒不能通过细胞培养方式增殖的缺憾，可用于模拟人类诺如病毒的感染和复制机制[4]。本文对MNV的病原学、流行病学、诊断学方法等进行综述，为该病的防控提供理论依据。

1 病毒学特征

诺如病毒(Norovirus，NoV)属杯状病毒科(Calicivirus)，诺如病毒属，无囊膜，二十面体对称，核酸为单链正股RNA，是导致急性胃肠炎暴发的重要病原体之一。据报道MNV是目前首个能够在细胞复制的诺如病毒，可在小鼠巨噬细胞和树突状细胞体外感染和复制[5]。

诺如病毒基因全长约7.3～7.8 kbp，含3个稳定的链环结构，具有5′端连接蛋白和3′端poly(A)尾巴。研究表明：3′端poly(A)对于RNA合成是非必需的。MNV基因组包含有3个开放阅读框架(open reading frames，ORFs)，命名为ORF1、ORF2和ORF3[6]。ORF1编码非结构蛋白，包括2C螺旋酶、3C蛋白酶和3D聚合酶基序。ORF2和ORF3则分别编码病毒的结构蛋白衣壳蛋白VP1和碱性蛋白VP2，其中VP1基因是诺如病毒属成员基因分型的依据。MNV各ORF间有部分基因重叠，但不同病毒株的ORF1和ORF2重叠基因的碱基个数存在差异[7]。此外，Thackray发现在MNVORF2中存在ORF4，但不在同一阅读框[8]。

MNV ORF1编码的氨基酸序列比ORF2更加保守。这是因为ORF1编码的聚合酶蛋白发生突变更有可能产生对病毒本身有害的无功能蛋白，而ORF2编码的衣壳结构蛋白发生有害突变的可能性小，并且可能作为逃避宿主免疫监视的一种方式[9]。衣壳蛋白VP1内部S区形成二十面体壳，P区形成衣壳蛋白的突出部分，因此S区更加保守，而P区作为主要抗原位点比S区更加暴露于宿主免疫系统的选择性压力之下[10]。Bailey等发现部分毒株在VP1的第296位点发生了谷氨酸的突变，推测该突变是适应细胞培养环境的结果。而原始株MNV1的赖氨酸残基是免疫功能不全宿主在特定的选择压力下的结果[11]。

2 流行病学

MNV在世界范围内广泛传播。Rodrigues等[12]对巴西地区的359只小鼠进行RT-PCR检测，MNV的感染率为38.16%。Mumphrey等[13]用血清学的方法检测美国和加拿大地区实验小鼠诺如病毒感染率约为22.1%，是细小病毒感染率的9倍。对欧洲地区实验小鼠MNV感染情况进行检测，发现MNV感染率高达58%～64%[14]。2012年，日本报道野生啮齿类动物中MNV感染率为14.9%[15]。在我国，袁文等用荧光定量RT-PCR的方法检测344份小鼠盲肠内容物，阳性率29.94%[16]。马畅等[17]对江苏地区MNV的感染情况进行检测发现，抽检的实验小鼠MNV感染率为13.3%,考虑MNV可能在同一设施内传播。MNV已成为目前实验小鼠感染率较高的一种病毒。

3 临床症状

对于不同的免疫缺陷动物，感染诺如病毒后症状有一定的差异。先天性免疫系统应答因子缺陷的小鼠，如STAT-1-/-小鼠、I型和II型干扰素受体同时缺陷(IFNαβ R-/-/IFNγR-/-)小鼠发生致死性感染，表现为体重减轻、竖毛和拱背等临床症状，但RAG-1-/-/RAG-2-/-小鼠感染MNV后仍能存活，在持续感染后90天仍能检测到病毒存在[18]，表明在某些免疫缺陷动物体内MNV能够持续感染。

免疫活性小鼠和大多数免疫缺陷小鼠感染MNV后不表现临床症状和病理变化，但该病毒疑似能够改变实验小鼠的表型，主要是引起炎症和免疫反应。动物诺如病毒很少引起严重的临床症状，只有鼠类诺如病毒会引起宿主体内发生严重的组织病理性损伤。在免疫功能不全的动物中诺如病毒常引发严重的临床症状，如可使新生犊牛的肠胃炎症状加重或复杂化。

4 病理变化

MNV能够引起RAG-2-/-/STAT-1-/-小鼠死亡，临床症状表现为脑炎、脑血管炎、肺炎和肝炎等。试验鼠接种病毒5周后，其脾脏、肠系膜淋巴结和空肠中能检测到MNV-Ⅰ型的RNA不同基因品系的免疫缺陷的小鼠感染MNV-Ⅰ型后出现全身性感染以及不同组织(肺、肝、腹膜和胸膜腔)的炎性症状[13]。免疫机能健全的小鼠感染MNV-Ⅰ型后仅表现一定程度的组织病理变化。因此，可以认为该病仅发生于先天性免疫系统缺乏的小鼠中。而在北美地区分离到的新型MNV(Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型)与Ⅰ型毒株在致病性上存在一定差异，将这3种MNV毒株和MNV-Ⅰ型毒株对免疫功能正常的小鼠进行人工感染试验，结果发现，MNV-Ⅰ型毒株的感染过程短暂，新发现的3种毒株感染后小鼠排毒期长，而且呈现慢性组织感染[19]。由此可以推断其他的人类诺如病毒毒株或动物诺如病毒毒株同样会引起这些类似症状，从而可能导致病毒传播和疾病暴发。

5 诊断

目前MNV的诊断方法主要为分子生物学方法和血清学方法。

RT-PCR已广泛应用于诺如病毒的检测，成为诺如病毒诊断的金标准，其敏感性及特异性均较好。但由于杯状病毒科基因组高度变异性，学者选择多种不同引物对MNV进行检测。基于小鼠诺如病毒与人类诺如病毒序列的分析，保守性的非结构蛋白编码序列常作为检测的目的片段。随着MNV全基因组序列的测定和分析，MNV的5′端和ORF1-ORF2连接位置存在的32 bp和64 bp的保守序列，ORF4和3′非编码区间47 bp和73～83 bp的保守序列，为PCR诊断方法的建立奠定基础。Kitajima等建立了适合于本地区MNV检测的巢式RT-PCR，比常规的PCR敏感性更高，而建立的荧光定量RT-PCR方法将病毒检测定量化[20]。袁文等建立了一种结合内标的荧光定量RT-PCR方法，其检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍，比病毒分离高100倍，能有效地监控假阴性的出现，适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查[16]。高洁等[21]成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法，并对北京地区实验小鼠MNV感染情况进行调查，结果显示阳性率为39.3%。

血清学方法主要为ELISA方法。Xiang等[22]利用表达的重组蛋白VP1建立ELISA方法具有较好的特异性和敏感性，对中国的600份小鼠血清进行检测发现，MNV阳性率为11.67%，其中商品化实验小鼠阳性率(30.97%)远高于非商业化销售小鼠。

6 预防和控制

设施消毒是预防MNV在实验动物饲养和研究设施中传播的重要环节。MNV在常温下尤其是在潮湿的粪便中十分稳定，但利用巴氏消毒法(63 ℃～72 ℃)几秒钟病毒即可被灭活[23]。电离(紫外线)和非电离(伽玛射线)照射同样可灭活病毒[24]。400 MPa高压处理5 min可使MNV活力降至无检出水平。与物理灭活方法相比，化学处理对MNV的效果较差。MNV在pH值2～10具有较强的稳定性，次氯酸盐浓度需达到300 μg/mL才能灭活病毒，氯仿、70%乙醇、氟化物和Vertrel清洗剂对病毒在很大程度上是无效的[25]。利用PCR方法对高压后的垫料、饲料和饮水进行定期检测有助于控制该病毒的传播。在饲养管理方面，屏障内工作人员应严格执行屏障生产设施标准操作规范，外购动物进入动物设施前要了解动物健康情况，严禁有流行病史动物进入。另外，还应该避免野生小鼠、蚊蝇和昆虫进入动物房。动物饲养人员要经过对皮肤表面和服装消毒之后方可进入动物房内，禁止外来人员进入。

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