Hippo-YAP信号通路在心脏发育和心肌再生中的作用

罗志荣 韩小晶 邵水金 蔡 昊 国海东

(上海中医药大学基础医学院解剖教研室，上海 201203)

·综 述·

Hippo-YAP信号通路在心脏发育和心肌再生中的作用

罗志荣 韩小晶 邵水金 蔡 昊 国海东

(上海中医药大学基础医学院解剖教研室，上海 201203)

Hippo信号通路；YAP；心脏发育；心肌梗死

心脏是哺乳动物胚胎发育过程中最先形成的器官，也是机体内最重要的器官之一，其发育及分化过程中受到多种信号通路的协同调控。近年来，Hippo信号通路作为一种在进化过程中非常保守的细胞抑制生长性信号通路，在心脏发育和心肌梗死后心脏修复方面受到重视，成为研究的热点之一。

1 Hippo-YAP信号通路

细胞的增殖、迁移及凋亡等是人体重要的生理与病理过程，对机体的功能发挥重要的调控作用。Hippo信号通路是多细胞动物体内调节细胞增殖和凋亡的主要信号通路之一。Hippo信号通路最初在果蝇功能基因筛选中被发现，是由一系列蛋白激酶及转录共激活因子所组成的激酶链，可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡〔1,2〕，并且在胚胎发育和组织器官的形成过程中具有重要的作用〔3〕。在哺乳动物中，也存在着类似的信号通路。Hippo通路主要由上游信号分子( Fat、FRMD、NF2、KIBRA等)、核心激酶级联反应链和下游调节因子(TEAD1/4、Wbp-2、RASSF、Ajuba)等三部分组成〔4〕，其核心成分则由MST1/2及它的共因子SAV、LATS1/2和它的调节蛋白Mob1、效应器Yes相关蛋白(YAP)以及它的类似物TAZ组成。这些分子结构彼此间相互作用，构成哺乳动物细胞信号转导通路，通过平衡细胞增殖和凋亡，调节生长发育。MST1/2作为蛋白激酶可以与其共因子SAV作用，并磷酸化下游的LATS蛋白，LATS蛋白继而可使YAP /TAZ磷酸化，磷酸化的YAP和TAZ可与胞浆中14-3-3蛋白结合而停留在细胞质中，不能进入细胞核，并被蛋白酶体系统降解，从而限制了YAP/TAZ促增殖和抗凋亡的功能。当Hippo信号通路被阻断或失活，YAP/TAZ 则发生去磷酸化，进而转位入核，并与TEAD 等下游调节因子相结合，促进下游靶基因的表达，从而发挥促增殖和抗凋亡活性〔5〕。

YAP是一种多功能细胞内连接蛋白和转录共激活因子〔6〕，也是第一个被发现与非受体型蛋白酪氨酸激酶YES1 结合的蛋白，并在Hippo 信号通路中起中心枢纽作用。YAP由WW 结构域、SH3 绑定基序、14-3-3 蛋白结合位点、羧基末端的PDZ 绑定基序、氨基末端的富脯氨酸结构域及位于转录调节结构上的CC 结构域组成〔7〕。YAP 有两个剪切异构体，根据所含WW结构域的数目可将其分为YAP1(含有一个WW 结构域)和YAP2(含有两个WW 结构域)，且YAP2比YAP1具有更强的转录调节活性，但这两种亚型之间的转换调控机制目前尚不清楚。YAP 作为一个转录共激活因子，具有很强的转录活性，但它不能直接与DNA结合，只能通过与转录因子相互作用被带到启动子区域发挥作用，可以与其相结合的转录因子有TEAD 家族、RUNX1/2 、Smad1 等，但其激活机制目前尚不清楚〔8〕。YAP的活性和肌动蛋白细胞骨架的摄动有高度敏感性，并通过α辅肌动蛋白和血管动蛋白被调节，形成YAP-14-3-3蛋白磷酸化复合物，从而抑制细胞的增殖〔9〕。

TAZ最初作为14-3-3 结合蛋白被发现，是YAP的类似物。其磷酸化后可以与14-3-3 蛋白结合而移出细胞核。在序列上，TAZ与YAP 约有50%的同源性，但在功能上与YAP 类似，TAZ也高度依赖TEAD 家族转录因子发挥转录活性。但TAZ 和YAP 通过某些转录因子发挥不同的功能，如Smad2/3和Pax3等〔8〕。

研究表明，具有30多个组件的Hippo信号通路是由内在的细胞机制调控的，例如细胞极性、细胞-细胞接触和肌动蛋白细胞骨架以及一系列的信号，包括细胞能量状态和通过G蛋白耦联受体起作用的激素信号等。目前，这些调控信号如何激活其下游蛋白MST1/2尚未完全阐明〔10〕。

2 Hippo-YAP 信号通路与心脏发育

心血管疾病，尤其是缺血性心肌病导致心肌细胞的丢失，最终引起心力衰竭，成为世界范围内的主要致死原因之一。常规治疗心脏疾病的方法，由于不能弥补心肌细胞的缺失而疗效有限。过去十多年里，人们在干细胞疗法对心脏损伤的修复研究中花费了大量的精力和资源〔11～13 〕。所以，如何补充新的心肌细胞对受损心脏的修复至关重要。早期实验研究发现，Hippo信号通路在胚胎发育和组织器官的形成过程中起着关键的作用〔3〕。而在个体发育过程中，对器官发育大小的精确控制至关重要。YAP被认为是促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的一种蛋白。近年来，关于Hippo-YAP信号通路在心脏发育中作用的研究越来越多。已证明YAP激活可以调控胚胎期心脏的发育〔14～16〕，促进新生和成年心肌细胞的增殖〔16～19〕及新生小鼠心脏的再生能力〔18,20〕。

2.1 Hippo-YAP信号通路调控胚胎期心脏发育 Hippo-YAP 信号通路可调节胚胎心脏的发育和心肌细胞的增殖〔14,15,21〕。Xin等〔14〕研究表明，YAP在小鼠胚胎期心脏发育中极其重要，有丝分裂细胞中存在磷酸化组蛋白H3(PH3)，研究者们通过PH3免疫组化染色，发现胚胎心脏YAP敲除小鼠与同窝对照小鼠相比心肌细胞增殖减少。在心脏发育早期通过Tnnt2 Cre，使小鼠胚胎心脏YAP失活，阻碍了胚胎心肌细胞的增殖，造成胚胎心肌发育不全和胚胎死亡〔17,22〕。YAP缺乏小鼠会导致卵黄囊血管、尿囊附件缺失以及胚轴延长等，最终导致小鼠在胚胎期死亡〔23〕。相反，过表达胚胎心脏中组成型活性形式YAP，可以增加胚胎心肌细胞数量和心脏的体积。YAP通过激活心肌细胞中胰岛素样生长因子信号通路，导致糖原合成酶激酶-3失活，进而引起β-连环蛋白(β-catenin)含量的增高，β-catenin是心脏生长的正调节因子，从而促进心脏的生长〔14〕。

为了研究YAP在心脏组织中表达的特点，von Gise等〔16〕分离了胎鼠、新生小鼠及成年小鼠的心肌细胞及非心肌细胞，结果发现在心脏发育的不同阶段，心肌细胞和非心肌细胞中都有YAP1的表达，且心脏中YAP1蛋白含量随年龄的增长呈逐渐减少的趋势。实验还证明了YAP1在维持正常心肌细胞增殖方面起着至关重要的作用，激活YAP1能促进胚胎及出生后心肌细胞的增殖。del Re等〔17〕也发现小鼠胚胎心肌细胞中YAP1特异性失活会导致心肌细胞的凋亡、纤维化、扩张型心肌病和过早死亡等。

MicroRNA簇miR302-367可抑制Mst1、Lats和Mob1b mRNA的表达，促进YAP入核以及心肌细胞的增殖〔23〕。这些miRNA在胚胎期表达达到峰值，出生后及成年阶段不表达，表明其在心脏发育早期对心肌细胞增殖的重要性。

Tbx5作为一个转录因子，被认为是胚胎心脏发育的调节器之一，Tbx5可以被YAP/TAZ共激活，这表明Hippo信号通路可能参与早期心脏的发育〔24〕。

这些研究结果表明，在心脏早期发育过程中Hippo信号通路组件的重要性及YAP活性的平衡对正常心脏形成的意义。Hippo-YAP信号通路在胚胎期心脏的发育过程中发挥重要调控作用。

2.2 Hippo-YAP信号通路参与新生期心脏发育 新生小鼠在心尖切除术或心肌梗死后，心脏仍具有强大的再生能力〔25,26〕。新生小鼠心脏的再生程度类似于斑马鱼，可以再生出不同的组织〔22,27〕。为了研究YAP与新生小鼠心脏的关系，Xin等〔18〕对出生2 d后对照组和YAP基因敲除小鼠的心脏行冠状动脉左前降支结扎(LAD)，结果显示对照组小鼠心脏在28 d得到完全的再生，仅有一个小的疤痕，并在结扎的远端出现正常的心肌组织；而YAP基因敲除小鼠在梗死后，整个左室游离壁上，出现广泛的纤维化梗死区，正常心肌数量显著减少，实验结果提示YAP缺失会影响新生小鼠心脏的再生能力。

然而，小鼠出生1 w后，心脏便丧失了再生能力〔25,26〕。为了研究是否可以通过激活YAP表达来延长心脏再生时间，Xin等〔18〕分别对出生7 d的YAPS112A转基因小鼠和WT小鼠行LAD手术，结扎后21 d WT小鼠心脏出现一个较大的疤痕组织，正常心肌组织缺失，并出现心室扩张；而YAPS112A转基因小鼠的心脏明显再生，几乎没有疤痕组织。结果显示激活YAP能增强新生小鼠心脏的再生。Novoyatleva等〔28〕发现肿瘤坏死因子相关弱凋亡诱导因子(TWEAK)是新生期心肌细胞增殖的正性调控因子。大鼠心肌细胞经TWEAK刺激后，DNA合成增加，增殖标记物细胞周期蛋白D2和Ki67表达提高，细胞周期抑制蛋白p27KIP1的水平下调，更重要的是TWEAK的刺激会引起细胞有丝分裂增加，最终导致心肌细胞数量的增加。在培养的心肌细胞内，应用腺病毒表达系统，可上调YAP的活性及增加Ki-67、磷酸化组蛋白H3、Brdu的阳性表达〔14,16,17〕。最近，Yang等〔29〕发现，YAP可通过调控新生心肌细胞中miR-206的表达诱导心肌细胞肥大和抑制心肌细胞凋亡，而过表达叉头蛋白(FOX)P1可以削弱miR-206介导的心肌肥大和细胞存活，提示FOXP1是miR-206的功能性靶点。因此，YAP可通过沉默POXP1增加miR-206的表达，从而在调节肥大和存活中发挥重要作用。又有研究表明Pi3kcb连接Hippo-YAP和Pi3k-AKT信号通路，体内Pik3cb过表达可激活AKT并诱导心肌细胞的增殖〔30〕。

2.3 Hippo-YAP信号通路调控成年心肌细胞的增殖 成年哺乳动物心肌细胞在出生后不久便永久性地退出了细胞周期〔31,32〕。成年小鼠心脏中YAP的特异性激活可刺激心肌细胞重新进入细胞周期，促进心肌细胞增殖，并且对心脏的功能不会产生有害的影响〔19〕。也有研究表明Hippo-YAP信号通路与其他信号通路(胰岛素样生长因子、Wnt信号通路)之间的“串话”，可刺激细胞周期基因的表达，促进心脏的生长〔14〕。最近的研究发现，成年心肌细胞Tbx20过表达可激活Hippo-YAP信号通路，降低YAP的磷酸化，从而促进心肌细胞的增殖〔33〕。体内活性YAP的异位表达也能促进心肌细胞的增殖，这并不局限于新生心肌细胞〔16,18,19〕，条件性敲除成年小鼠心脏SAV1可增加YAP的活化，从而促进心肌细胞的增殖〔20〕，进一步证明了Hippo-YAP信号通路调控成年心肌细胞的更新。α-连环蛋白通过调节YAP活性控制细胞的增殖，出生后特异性的敲除小鼠α-连环蛋白可提高成年心肌细胞的增殖〔34〕。

3 Hippo-YAP信号通路参与心肌损伤修复

心肌梗死造成数十亿心肌细胞的损失，尽管现代医学和外科手术水平有所提高，但梗死后由于心肌细胞的缺失会降低心脏的泵血功能，甚至会引起心脏衰竭。导致这一现象的根本原因是心肌细胞无法增殖或增殖的程度十分低下，关于心肌梗死治疗的研究，目前包括干细胞移植、刺激心肌细胞增殖和成纤维细胞转分化等多种治疗手段，而通过刺激心肌细胞重新进入细胞周期来增加心肌细胞数是其中较有潜力的研究方向。

YAP作为转录共激活因子，可以与转录因子(尤其是TEAD12)结合，从而激活细胞周期的表达，促进器官的发育和细胞的增殖。YAP的表达受到严格的控制，过表达会造成组织的过生长和肿瘤，表达不足则会造成组织的发育不全〔35〕。斑马鱼和新生小鼠心脏的再生与受损组织心肌细胞增殖系统的全面激活有关〔26,36,37〕。Xin等〔18〕通过氯化三苯四氮唑(TTC)染色显示结扎后心脏缺血区域，发现YAP转基因小鼠和WT小鼠心脏都出现不同程度的心肌梗死，而YAP转基因小鼠心脏的损伤程度则为轻度到中度。转基因小鼠和WT小鼠相比，心肌梗死后纤维化疤痕较小。结果表明，YAP的过表达降低了心脏的损伤程度。对心功能进行检测发现，结扎7 d后小鼠的射血分数(EF)和短缩分数(FS)，相比结扎前都有所下降，但 YAP转基因小鼠EF和FS高于WT小鼠，梗死后21 d YAP转基因小鼠的心脏功能也明显高于WT小鼠。以上表明梗死后心肌细胞中YAP的表达能维持成年受损心脏的功能。Li等〔32〕也证明了心肌梗死后YAP 的激活能维持心脏的功能和减少梗死面积。他们用腺病毒亚型(AAV)9作为载体，将人YAP表达在成年小鼠心肌细胞内，当成年小鼠心肌梗死后，AAV9:hYAP明显提高了小鼠心脏的功能和存活率，AAV9:hYAP并没有明显降低胚胎心肌细胞的凋亡，而是促进梗死后成年心肌细胞的再生，基因表达谱显示AAV9:hYAP能够刺激细胞周期基因的表达。YAP可以上调miR-206的表达，而心肌特异性过表达miR-206可诱导心肌肥大，并可保护缺血再灌注心脏损伤，抑制miR-206可加剧缺血再灌注导致的心肌损伤，说明YAP可能通过调控miR-206参与心肌损伤后的保护作用〔29〕。更有研究表明通过激活Hippo信号通路缺陷的成年大鼠心脏内源性YAP(心脏特异性SAV、LATS1/2缺失)可防止心肌梗死〔20〕。

尽管成年心肌细胞永久地退出细胞周期，心肌梗死后心脏再生能力十分有限，但增加YAP的表达或激活已存在的YAP有利于心肌损伤后的修复，这也为缺血性心肌病的治疗提供了新的思路和参考。

4 展 望

心肌梗死后Hippo-YAP信号通路的激活可刺激心肌细胞增殖，维持心脏的功能和减少梗死面积，在心脏发育、心肌细胞增殖及心肌修复方面具有重要的作用。此外，有研究者认为Hippo-YAP通路的基因突变或异常，可能与人类先天性心脏病的发病机制相关，对Hippo-YAP组件的分析，有利于人类先天性心血管疾病的诊断。因此，深入了解Hippo-YAP信号通路在心脏发育和再生中的作用机制，可为心肌梗死后的治疗提供新的研究方向。

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〔2016-10-17修回〕

(编辑 李相军)

国家自然科学基金(81673729)；上海市教育委员会科研创新项目(14YZ053)；上海市自然科学基金(16ZR1437300)

国海东(1981-)，男，博士，副研究员，硕士生导师，主要从事中医药防治心脑血管疾病研究。

罗志荣(1991-)，女，硕士，主要从事中医药调控干细胞移植治疗心肌梗死研究。

R329.1

A

1005-9202(2017)08-2052-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.103