低氧对前列腺间质细胞活性氧、低氧诱导因子-1α、雄激素受体表达的影响及依达拉奉的干预作用

李晓娜 任海林 陈国俊 李 宁 侯 智 索吉明

(青海省人民医院分子病理实验室，青海 西宁 810007)

低氧对前列腺间质细胞活性氧、低氧诱导因子-1α、雄激素受体表达的影响及依达拉奉的干预作用

李晓娜 任海林1陈国俊1李 宁1侯 智1索吉明1

(青海省人民医院分子病理实验室，青海 西宁 810007)

目的探讨低氧环境下活性氧(ROS)在前列腺增生中的作用及依达拉奉对其的干预作用。方法流式细胞仪检测前列腺增生组织及原代培养细胞中ROS的表达，低氧条件下观察前列腺间质细胞ROS及生长变化，荧光定量PCR法检测低氧诱导因子(HIF)-1α、雄激素受体(AR)的变化。低氧条件下用依达拉奉干预后，检测细胞生长及ROS、HIF-1α、AR的变化。结果前列腺增生组织及3%O2条件下细胞ROS均明显升高(P<0.01)，3%O2条件下细胞增殖升高(P<0.01)；HIF-1α、AR表达上调(均P<0.05)；在3%O2条件下依达拉奉干预后，ROS明显降低(P<0.01)，HIF-1α明显下调(P<0.05)；细胞增殖明显下降(P<0.01)。结论低氧及低氧环境刺激产生的ROS在前列腺增生中可能起关键作用。

低氧；活性氧；低氧诱导因子-1α；雄激素受体；前列腺增生

局部缺氧和炎症反应是前列腺增生两大病因学说〔1〕，活性氧(ROS)是两大病因学说中的关键因子。低氧诱导因子(HIF)-1α是缺氧条件下调节氧稳态平衡的重要因子，雄激素受体(AR)是前列腺细胞增殖的重要基因。本文探讨ROS、HIF-1α、AR在前列腺增生的发生发展中的角色。

1 材料与方法

1.1前列腺间质原代细胞 人前列腺间质细胞取自经尿道前列腺电切组织，年龄67～86(平均72.5)岁，并经病理证实为良性前列腺增生。对照组年龄37～46(平均43.5)岁，为男性膀胱癌患者6例，在膀胱癌手术过程中取其少量前列腺组织，经病理证实排除前列腺增生和前列腺癌。患者均签署知情同意书。

1.2试剂、药物及仪器 荧光探针Carboxy-H2-DCFDA(Invitrogen公司)，AnnexinⅤ FITC/PI凋亡及增殖检测试剂盒(Beckman Coulter公司)，HIF-1α、AR的引物和荧光探针以及内参GAPDH均为ABI公司订购的商用成品。氧自由基清除剂依达拉奉(南京森贝伽生物科技有限公司，纯度>98.5%，批号89-25-8)。SQP-100S三气培养箱(天津玛福尔科技有限公司)，HT7900荧光定量PCR仪(ABI公司)，流式细胞仪(Beckman Coulter公司)。

1.3前列腺间质原代细胞培养、鉴定及细胞内ROS检测 按照原代培养的标准方法处理组织〔2〕后，置于37℃，21%O2，5%CO2培养箱中培养并传代，取生长良好的传代细胞爬片。根据取材前治疗分为两组：经5α-还原酶抑制剂治疗和未经5α-还原酶抑制剂治疗组，机械法粉碎增生前列腺组织后，用300目尼龙网过滤细胞得到单细胞悬液。按照文献报道方法〔3〕用无血清培养液稀释Carboxy-H2-DCFDA探针终浓度为10 μmol/L，待检测细胞去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的探针，37℃细胞培养箱内孵育30 min，离心细胞并收集，以磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，上流式细胞仪检测。两种组织激发光均为氩离子激光488 nm谱线，使用仪器自带的CellQest软件分析平均荧光强度。

1.4流式细胞仪检测培养细胞凋亡和增殖 按照凋亡、增殖检测试剂盒操作说明要求处理细胞后，上流式细胞仪检测培养细胞凋亡率和细胞增殖活性，WinMDI软件分析数据。

1.5低氧条件下观察前列腺间质细胞及ROS变化 取原代培养的前列腺间质细胞第5～7代细胞进行，将生长良好的细胞按氧浓度分组：细胞低氧培养用SQP-100S三气培养箱，分别在3%O2，1%O2浓度下培养48 h，对照在21%O2下培养。按前述方法检测各组细胞ROS、增殖活性和凋亡变化，HT7900荧光定量PCR仪检测HIF-1α、AR mRNA变化。检测方法为相对定量分析2-△△Ct法。HIF-1α、AR的引物和荧光探针以及内参GAPDH均为ABI公司订购的商用成品，反应条件及操作均按照试剂盒说明进行。每个样品每次试验至少设立3个重复，重复3次试验。

1.6依达拉奉干预对前列腺间质细胞ROS、细胞生长及HIF-1α、AR mRNA表达的影响 3%O2浓度下培养细胞，依达拉奉干预浓度为50、80 μmol/L。对照组予同剂量生理盐水。流式细胞仪检测各组ROS及细胞生长情况。荧光定量PCR法检测HIF-1α、AR mRNA。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组ROS比较 免疫组化结果显示原代培养的人前列腺间质细胞经5～7代后，其成分主要为平滑肌细胞及成纤维细胞，符合前列腺间质细胞的组织学特点。前列腺增生组织匀浆中ROS浓度〔(82.727±15.923)%〕较正常前列腺组织匀浆明显升高〔(40.947±10.079)%,t=10.732,P<0.01〕，但21%O2培养细胞中ROS浓度明显下降〔(31.680±11.079)%,t=-6.521,P<0.01〕。经5α-还原酶抑制剂治疗和未经5α-还原酶抑制剂治疗的前列腺组织中ROS浓度无统计学意义〔(84.527±13.774)%、(82.727±15.923)%，t=2.032，P>0.05〕。3%O2培养后细胞ROS较21%O2明显增高〔(84.094±10.994)%，P<0.01〕，依达拉奉干预可以降低ROS水平〔(37.380±9.986)%,t=-19.188,P<0.01〕。

2.2细胞增殖、凋亡情况 与21%O2培养〔(15.193±1.446)%〕相比，3%O2培养条件下细胞处于增殖期，G2/S期比例增多〔(21.267±2.866)%,t=7.809,P<0.01〕；依达拉奉干预则可降低G2/S期比例〔(18.362±1.681)%,t=3.523,P<0.01〕。与3% O2培养〔(2.685±0.35)%〕相比，1%O2细胞凋亡增加〔(27.919±4.249)%,t=-23.458,P<0.01〕，依达拉奉干预可上调细胞凋亡率〔(12.657±1.400)%,t=24.783,P<0.01〕。

2.3依达拉奉干预对前列腺组织间质细胞ROS、增殖及HIF、AR mRNA的影响 与对照组细胞ROS水平〔(82.727±15.923)%〕比较，80 μmol/L依达拉奉可以明显降低ROS水平〔(39.569±11.271)%，t=13.423,P<0.01〕，50 μmol/L依达拉奉组ROS水平无明显变化〔(80.716±14.812)%，t=1.746,P>0.05〕。与对照组细胞增殖率〔(21.267±2.866)%〕比较，80 μmol/L依达拉奉组细胞增殖明显下降〔(18.362±1.681)%，t=3.523,P<0.01〕。80 μmol/L依达拉奉组HIF-1α mRNA表达(2.657±0.413)较对照组明显下降(2.828±0.318，t=2.708,P<0.05)，而AR mRNA表达(2.155±0.373)与对照组无统计学差异(2.335±0.443，t=2.040,P>0.05)。

3 讨 论

前列腺增生的病因有许多学说，但公认的只有两点：老化和有功能的睾丸。但目前用于抗雄激素治疗的两类5α-还原酶抑制剂并不能阻止前列腺增生的临床进展，本研究检测经5α-还原酶抑制剂治疗和未经5α-还原酶抑制剂治疗的前列腺组织中ROS的变化无差异。相关研究也发现，经过和未经过5α-还原酶抑制剂治疗患者其前列腺组织中炎症细胞的表达也是无差别的〔4〕。前列腺增生是一种公认的老化性疾病，ROS在老化中的作用也日益受到重视〔5〕，但目前从老化角度研究前列腺增生的文献较少。有理由认为在老化因素作用下，前列腺局部微环境变化，导致了前列腺的第2次“发育”，但其关键的启动因素有待进一步研究。老化的典型改变包括局部血管老化而继发的损害，并由此导致局部缺血和低氧，研究已经证实低氧在一定条件下可以刺激增殖〔6〕，因此我们推测低氧刺激可能就是前列腺增生的初始原因之一。低氧可以通过线粒体黄嘌呤氧化酶、吞噬细胞、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)等途径产生大量ROS〔7〕。本研究发现前列腺组织匀浆中ROS浓度明显升高，但培养细胞中ROS浓度明显下降，可能与培养细胞是在常氧条件下有关。研究发现在适度的ROS刺激下，细胞开始增殖并同时表达DNA修复因子和抗氧化酶〔8〕。尽管不同组织来源的细胞对ROS反映的浓度是不一致的，但共同的一点是：低浓度刺激细胞生长，高浓度导致细胞凋亡或者死亡〔6〕。ROS本身或者进一步激活其他增殖、凋亡相关基因，可能导致细胞增殖或者凋亡，除涉及ROS本身的浓度和类别外，还涉及不同的细胞类型、密度、信号传导通路、DNA表达和酶激活等方面。HIF-1α是缺氧条件下广泛存在于人体内的一种调节氧稳态平衡的重要因子，HIF-1α可以进一步启动下游一系列生长调控基因，使得机体适应低氧，并在低氧环境下继续生长发育，在许多肿瘤研究中已经证实。AR激活后可以启动、明显促进前列腺细胞的增殖〔9〕。本研发现在低氧刺激后，前列腺间质细胞HIF-1α、AR mRNA表达明显上调，前列腺间质细胞处于增殖期。而当依达拉奉干扰ROS后，前列腺间质细胞的HIF-1α mRNA表达下调，尽管AR mRNA无明显变化，但前列腺间质细胞生长受到抑制。ROS与HIF-1α、AR及依达拉奉的相互关系仍需进一步研究。局部炎症反应在前列腺增生的中的作用日益受到重视〔1〕，炎症刺激可以通过白细胞内NADPH途径产生大量ROS〔10〕。本研究发现适度的ROS可以刺激前列腺间质细胞增殖，依达拉奉干预ROS后，细胞增殖下降，并出现凋亡增加。因此，低氧环境刺激产生的活性氧在前列腺增生可能起关键作用，提示改善局部缺氧状态和抑制局部ROS可能是前列腺增生治疗的新方向。

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2Fibbi B，Morelli A，Vignozzi L，etal.Characterization of phosphodiesterase type 5 expression and functional activity in the human male lower urinary tract〔J〕.J Sex Med，2010；7(1)：59-69.

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4Vignozzi L，Cellai I，Santi R，etal.Antiinflammatory effect of androgen receptor activation in human benign prostatic hyperplasia cells〔J〕.J Endocrinol，2012；214(1)：31-43.

5Vigneron A，Vousde KH.p53，ROS and senescence in the control of aging〔J〕.Aging，2010；2(8)：471-4.

6Regina MD，Yuichiro JS.Cell proliferation，reactive oxygen and cellular glutathione〔J〕.Dose Response，2005；3(3)：425-42.

7Martínez-Reyes I，Chandel NS.Mitochondrial one-carbon metabolism maintains redox balance during hypoxia〔J〕.Cancer Discov,2014；4(12)：1371-3.

8Kretova M，Sabova L，Hodny Z，etal.GF-β/NF1/Smad4-mediated suppression of ANT2 contributes to oxidative stress in cellular senescence〔J〕.Cell Signal，2014；26(12)：2903-11.

9Eder IE，Culig Z，Putz T，etal.Molecular biology of the androgen receptor：from molecular understanding to the clinic〔J〕.Eur Urol，2001；40(3)：241-51.

10Carbone F，Camillo Teixeira P，Braunersreuther V，etal.Pathophysiology and treatments of oxidative injury in ischemic stroke：focus on the phagocytic NADPH oxidase 2〔J〕.Antioxid Redox Signal，2014；22(12)：2141-9.

R697+.32

A

1005-9202(2017)24-6021-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.007

青海省自然科学基金(No.2012-Z-939Q)

1 青海大学附属医院泌尿外科

任海林(1973-)，男，博士，副主任医师，主要从事泌尿系统相关疾病研究。

李晓娜(1978-)，女，硕士，副主任技师，主要从事高原医学基础研究。

〔2016-01-11修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)