高表达的Wnt分泌蛋白1促进肺癌化疗耐受

贾小婷 罗利云 李 楠 (广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510095)

高表达的Wnt分泌蛋白1促进肺癌化疗耐受

贾小婷 罗利云 李 楠 (广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510095)

目的探讨Wnt分泌蛋白(WISP)1在肺癌中的表达量及作用。方法生物信息学分析WISP1在肺癌及癌旁组织中的表达量，qRT-PCR检测肺癌组织及癌旁组织中WISP1 mRNA的表达。在肺癌细胞中干预WISP1的表达，检测处理后细胞化疗敏感性的变化。结果生物信息学分析免疫组化数据库联合qRT-PCR结果发现，WISP1 mRNA在肺癌中的表达量显著高于癌旁组织，且WISP1在肺癌化疗耐受组的表达量显著高于化疗敏感组。在肺癌细胞中敲低WISP1对化疗药物奥沙利铂的敏感性增加，反之亦然。结论WISP1在肺癌中高表达且促进肺癌化疗耐受。

Wnt分泌蛋白1；肺癌；化疗敏感性

肺癌治疗耐受机制不清楚，是其死亡率居高不下的主要原因〔1，2〕。Wnt分泌蛋白(WISP)1是结缔组织生长因子(CCN)家族的生长因子，能够被Wnt-1和β-cantenin诱导转录〔3〕；其在整个胚胎发育过程中都有表达，而且参与伤口愈合及组织修复〔4〕。WISP1异常表达与多种疾病(如骨关节病变、纤维化及肿瘤等)密切相关〔5〕。本文旨在探讨WISP1对肺癌化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1一般资料 人正常肺上皮细胞BEAS-2B及肺癌细胞H1650、H460、A549、95D、HCC827、H1975和H1299由本实验室保存。将上述细胞接种于含10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM(Gibco公司)培养液中，在37℃、5% CO2的培养箱中培养。本实验标本均来自本院组织标本库。收集未经过化疗或放疗处理的肺癌组织标本55例，其中化疗敏感组21例，化疗耐受组34例，同时收集肺癌患者癌旁组织标本38例。

1.2RNAs提取及逆转录 购买Omega公司生产的RNA Isolation Kit I试剂盒提取组织及细胞总RNAs。从液氮中取出30 mg组织放入预冷的研钵中，加入液氮磨碎组织。加入700 μl RTK裂解液(事先已加入β-巯基乙醇)，用1 ml注射器来回吹打液体10次，加入700 μl无水乙醇，轻微颠倒混匀，12 000 r/min，4℃离心15 min。上清上柱，10 000 r/min离心1 min。弃去废液，用500 μl RW1洗涤柱子1次，10 000 r/min离心1 min。弃去废液，用700 μl RW2洗涤柱子2次。空甩，12 000 r/min，3 min。用30 μl无核酶水溶解RNA，静置2 min。12 000 r/min离心2 min，获得RNA样品，用于后续逆转录。将目标细胞用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，弃废液，加入700 μl RTK裂解液(事先已加入β-巯基乙醇)，后续操作与组织提取RNA一致。购买Fermentas cDNA First Strand Reversing kit进行逆转录。配置逆转录体系：RNA 2 μg，oligo d(T)1 μl，水补足12 μl。65℃ 5 min，立即冰置2 min。加入4 μl反应缓冲物，1 μl RNA酶抑制剂，2 μl dNTP，1 μl 反转录酶。42℃ 1 h，70℃ 5 min。-20℃保存cDNA。

1.3qRT-PCR 反应：qRT-PCR购自Fermentas公司 SYBR Master Mix试剂盒，检测体系：SYBR 10 μl，正向引物0.8 μl，反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，用水补足20 μl体系。在BioRad荧光定量PCR仪上50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s共40个循环。

根据2-ΔΔct值计算相对表达量。引物序列：GAPDH-正向5′-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3′，GAPDH-反向5′-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3′；WISP1-正向5′-GATGCCTGTGCCACTGACGT-3′，WISP1-反向5′-GTTAGTCCCCAAGACCCA-AGATTT-3′。

1.4载体构建 使用软件Primer Premier 5设计引物，扩增WISP1开放阅读框。上游引物：5′-ATAggatccATGGCTGTGAGTGCTGTAAGAT-3′；下游引物：5′-TATctcgagCTAGTTGGCAATT-TCTGAGAAGTC-3′，其中小写字母表示限制性内切酶位点。用BamHI和XhoI消化PCR产物和pCMV-Flag载体，再用T4连接酶将酶切后的WISP1片段和载体连接起来，转化，测序鉴定阳性克隆并命名为pCMV-WISP1。

1.5Western印迹 RIPA温和裂解液(购自碧云天)裂解目标细胞，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。40 mg每孔蛋白的上样量将目标蛋白置于点样孔，待电泳结束，将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%牛奶封闭2 h，一抗4℃孵育过夜(抗β-actin，1∶500；抗WISP1，1∶1 000)，耦联的辣根过氧化酶(HRP)二抗孵育2 h，化学增强发光法(ECL)染色发光。在正常肺上皮细胞中转染质粒pCMV-WISP1，在肺癌细胞H1975中转染靶向WISP1的siRNAs(购自广州锐博生物有限公司)，48 h后Western印迹检测WISP1表达量。

1.6细胞活力测定(MTS)实验 以4 000个细胞/孔的密度接种目标细胞于96孔板，37℃、5% CO2的培养箱中培养过夜。每组细胞分别加入0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/L的奥沙利铂(oxaliplatin)，每个实验组设5个副孔。72 h后，加入20 μl/孔MTS，3 h后490 nm测量各孔的绝对吸光值。统计分析各组细胞的存活率。

1.7统计学方法 应用SPSS19.0统计学分析软件对数据的组间比较进行t检验。

2 结 果

2.1WISP1 mRNA在肺癌中的表达 WISP1 mRNA在肺癌组织中的表达量(6.43±2.29)显著高于癌旁组织(2.40±0.89，P=0.000)。在肺癌细胞H1650、H460、950、A549、HCC827、H1299、H1975中的表达量(1.36±0.08，1.99±0.06，2.74±0.23，2.96±0.06，3.58±0.19，5.19±0.15，24.92±4.19)显著高于肺上皮细胞BEAS-2B(1.00±0.00；P=0.027，0.002，0.009，0.000，0.003，0.001，0.015)。

2.2WISP1与肺癌化疗敏感性的关系 WISP1在化疗耐受组的表达量(7.17±2.40)显著高于化疗敏感组(5.24±1.47，P=0.002)。在BEAS-2B细胞中过表达WISP1，MTS结果显示WISP1可明显增加BEAS-2B细胞对化疗药物oxaliplatin的耐受性。采用siRNAs(购自广州锐博生物有限公司)沉默WISP1，Western印迹结果显示si-#3沉默效果最佳，用于后续研究。MTS结果显示敲低WISP1可显著提高H1975细胞对奥沙利铂的敏感性。见图1。

3 讨 论

目前关于WISP1在肿瘤中的作用尚未有定论。有学者发现WISP1在乳腺癌中扮演抑癌基因，WISP1在淋巴结转移组中的表达量低于淋巴结未转移组，在预后差组的表达量低于预后良好组的表达量〔6〕。但有研究发现WISP1发挥原癌分子效应。WISP1在多种肿瘤中过表达，可促进肿瘤的发展进程，与患者预后负相关〔7〕。在用人前列腺癌细胞建立的异种移植小鼠模型中，用WISP1中和抗体处理能够显著抑制瘤体生长和骨转移〔8〕。使用WISP1中和抗体缺失WISP1后能够引起放疗耐受的食管癌细胞有丝分裂障碍，但是对正常的食管癌细胞无影响〔8〕。WISP1可上调基质金属蛋白酶(MMP)-2，促进黏着斑激酶(FAK)、细胞外信号调节激酶(MEK)及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)发生磷酸化，促进细胞发生侵袭转移〔9〕。本研究发现WISP1在肺癌组织高表达，且与肺癌化疗耐受正相关。在肺癌细胞中敲低WISP1将增加该细胞的化疗敏感性。

1Torre LA，Bray F，Siegel RL，etal.Global cancer statistics，2012〔J〕.CA Cancer J Clin，2015；65(2)：87-108.

2Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016〔J〕.CA Cancer J Clin，2016；66(1)：7-30.

3Xu L，Corcoran RB，Welsh JW，etal.WISP-1 is a Wnt-1-and beta-catenin-responsive oncogene〔J〕.Genes Dev，2000；14(5)：585-95.

4Berschneider B,Königshoff M.WNT1 inducible signaling pathway protein1 (WISP1)：a novel mediator linking development and disease〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2011；43(3)：306-9.

5Gurbuz I,Chiquet-Ehrismann R.CCN4/WISP1 (WNT1 inducible signaling pathway protein 1)：a focus on its role in cancer〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2015；62(2)：142-6.

6Davies SR，Watkins G，Mansel RE，etal.Differential expression and prognostic implications of the CCN family members WISP-1，WISP-2，and WISP-3 in human breast cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2007；14(6)：1909-18.

7Ono M，Inkson CA，Sonn R，etal.WISP1/CCN4：a potential target for inhibiting prostate cancer growth and spread to bone〔J〕.PLoS One，2013；8(8)：e71709.

8Li WF，Zhang L，Li HY，etal.WISP-1 contributes to fractionated irradiation-induced radioresistance in esophageal carcinoma cell lines and mice〔J〕.PLoS One，2014；9(4)：e94751.

9Hou CH，Chiang YC，Fong YC，etal.WISP-1 increases MMP-2 expression and cell motility in human chondrosarcoma cells〔J〕.Biochem Pharmacol，2011；81(11)：1286-95.

R734.2

A

1005-9202(2017)24-6025-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.009

国家自然科学基金项目(81602016，81472184)；广州市卫计委一般引导项目(20171A011321)；广东省医学科学技术研究基金(A2017362)

李 楠(1983-)，女，主治医师，主要从事肿瘤化疗耐受机制研究。

贾小婷(1985-)，女，实验师，主要从事肿瘤化疗耐受机制研究。

〔2017-05-23修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)