髓源抑制性细胞参与慢性乙型肝炎免疫抑制的机制①

李雪莹 沈宇清

(东南大学医学院，南京210009)

髓源抑制性细胞参与慢性乙型肝炎免疫抑制的机制①

李雪莹 沈宇清

(东南大学医学院，南京210009)

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)所引发的、以肝脏炎性病变为主，并可使多种器官损伤的一种疾病。根据世界卫生组织2015年3月发布的《慢性乙型肝炎病毒感染、预防、关怀和治疗指南》显示，目前全球约有2.4亿慢性乙肝感染者，其中一部分患者会出现并发症并因此而死亡，每年约65万人因此而死亡[1]。慢性乙型肝炎的形成是由于机体的免疫系统无法彻底地清除肝脏中的HBV，病毒持续活化以及伴随的炎症反应过程给肝脏带来微量但长久的细胞损伤，而这种持续不断的肝损伤容易诱导肝硬化甚至肝癌的发生[2]。了解HBV逃避机体免疫应答的机制有助于针对这些机制设计慢性乙型肝炎的治疗方案。

慢性乙型肝炎病人体内免疫力减弱主要是因为抗病毒固有免疫的缺陷、T细胞的损耗以及肝脏耐受环境[3]。其中在肝脏受到免疫损伤后，髓源抑制性细胞(MDSCs)是形成肝脏免疫耐受环境的关键细胞之一。有很多研究表明，与正常情况相比，乙肝患者肝脏和外周血内有大量的MDSCs聚集[4-6]，且MDSCs的数目与肝炎的炎症反应剧烈程度呈负相关[7]。

1 髓源抑制性细胞的生物学特性

髓源抑制性细胞是一类由造血祖细胞和巨噬细胞、树突状细胞及粒细胞的前体所组成的异质性骨髓细胞群[8]，人体的MDSCs高表达CD11b、CD33，低表达人白细胞抗原DR。小鼠的MDSCs表达CD11b和Gr1(Ly6C/G)[9]。在小鼠体内，MDSCs可以根据光散射信号强弱和Gr1表达量的不同被细分为单核系髓源抑制性细胞(monocytic MDSCs,mMDSCs)和粒系髓源抑制性细胞(granulocytic MDSCs,gMDSCs)两个亚种群[10]；而人体内mMDSCs和gMDSCs的区分主要是CD14和CD15[11]。虽然有很多表面标志，但是确定这一类细胞的特定标志是非常困难的，因为它们几乎所有的表面分子都与其他的骨髓细胞如中性粒细胞、单核细胞或髓系树突状细胞相同或相似[12]。所以，功能的不同才是区分髓源抑制性细胞和其他骨髓细胞是最可靠的特征。MDSCs出现在体内的很多地方，如血液、骨髓、脾脏等。在健康人体内，MDSCs存在的量很少，大多数会快速分化成成熟的髓细胞。但在癌症、炎症和受感染患者体内含量会迅速升高。

许多研究都已经证明，MDSCs可以通过多种机制来营造出免疫耐受环境，在肿瘤中，可以通过耗尽精氨酸来抑制T细胞的功能[13,14]；通过诱导调节型T细胞(T regulatory cells,Tregs)来控制体内自身免疫反应[13,15]；通过一氧化氮(NO)抑制免疫细胞干扰素的分泌[16]。在丙型肝炎中，MDSCs通过ROS途径抑制T细胞免疫[17]。除了对适应性免疫反应有抑制作用以外，MDSCs还可以在固有免疫中通过与巨噬细胞直接接触和分泌IL-10调节巨噬细胞IL-12的分泌[18]；通过细胞间的接触来抑制自然杀伤性细胞的细胞毒性[19]。在非免疫方面MDSCs还有促进肿瘤血管生成和转移等功能。

2 髓源抑制性细胞与HBV相互作用

2.1 MDSCs数目与HBV各指标的关系 急性肝炎患者，其外周血中MDSCs的数目和病毒载量呈正比，和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的量呈反比，与HBeAg或HBsAg的浓度无关[6]。但是慢性乙肝患者外周血中mMDSCs的数目和HBsAg的浓度呈正相关[20]。而gMDSCs的数目与病毒载量、HBsAg或HBeAg的量均没有联系，而是与血清中ALT的量和炎症程度呈反比。因此gMDSCs较mMDSCs更能反映慢性乙肝病人的免疫活化以及肝损伤程度[4,21]。

2.2 HBsAg促进PBMCs向MDSCs的分化 在慢性乙型肝炎中，受HBV感染的肝细胞分泌的乙肝表面抗原(Hepatitis B surface Ag,HBsAg)是在外周血中最常见的HBV蛋白。Zhong等[20]发现外周血中HBsAg的浓度和mMDSCs的数目呈正相关关系。他们进一步实验，将健康人体内的外周血单核细胞(PBMCs)与外源的HBsAg共培养，结果发现与空白及牛血清蛋白处理的对照组相比，与HBsAg共培养的PBMCs中mMDSCs占的比例显著增加。乙肝e抗原和乙肝核心抗原都没有此效果。由此可认为，HBsAg可以促进PBMCs中的单核细胞分化成mMDSCs。

Zhong等[20]进一步研究，用HBsAg处理单核细胞后，培养液中IL-6、IL-8、IL-10含量均明显上升，其中IL-6含量上升最为显著。加入抗IL-6的抗体共培养后，mMDSCs的含量骤减。即使无HBsAg存在，在单核细胞和牛血清蛋白共培养时加入IL-6，也能明显促进单核细胞分化成mMDSCs，且在一定范围内，加入的IL-6越多，分化成mMDSCs的单核细胞也越多。由此可以认为，HBsAg促进单核细胞分泌IL-6，而IL-6是单核细胞分化成mMDSCs过程中的重要细胞因子。Zhong等[20]随后的深入实验发现ERK1/2和STAT3的磷酸化对mMDSCs的极化都很重要，HBsAg促进单核细胞分化成mMDSCs可能是通过ERK/IL-6/STAT3信号机制。

3 髓源抑制性细胞抑制免疫的机制

髓源抑制性细胞对T细胞的抑制性作用已经在众多疾病，特别是肿瘤研究中得到多次证明。但其在慢性乙肝中的作用机理还不是很明朗。MDSCs可能通过多种机制抑制T细胞的数目和功能。

3.1 细胞因子调控机制 MDSCs与T细胞共培养后抑制了T细胞IFN-γ的分泌，使产生IFN-γ的T细胞数目减少，PD-1的表达量上升(n=5,P<0.05)[5,22]。Huang等[6]发现MDSCs通过可溶性因子以剂量依赖的方式抑制自体细胞CD8+T细胞的增殖和IFN-γ的分泌。进一步研究发现在慢性肝炎患者体内的MDSCs中白介素10(IL-10)的转录量比普通人高出很多。加入IL-10的抗体后，对T细胞增殖和产生IFN-γ的抑制明显减弱。对PD-1的研究发现，加入PD-1特异性激动剂可以极大地促进MDSCs产生IL-10。由此可以认为在PD-1诱导下，MDSCs大量产生IL-10，从而抑制T细胞的增殖和IFN-γ的产生。Suh等[23]发现将MDSCs与肝星状细胞(D4 HSCs)共培养后，MDSCs中分泌IL-10的细胞数目会增加，从而提高IL-10的表达量。由此认为肝星状细胞对MDSCs的功能行使有促进作用。

3.2 酶调控机制 Kong等[22]检测携带HBV的小鼠体内的MDSCs，发现其大量表达精氨酸酶Ⅰ(Arg-Ⅰ)和一氧化氮合酶(inos)，并且将MDSCs与CD8+T细胞共培养后加入精氨酸酶Ⅰ抑制剂nor-NOHA或一氧化氮合酶抑制剂L-NMMA可以恢复CD8+T细胞的功能。用Arg-Ⅰ抑制剂处理携带HBV的小鼠发现，小鼠在治疗期内可以快速清除体内的HBeAg，血清中HBsAg的水平有所降低，针对HBV的特异性免疫也逐渐恢复。所以这两种酶都对T细胞有抑制的作用。

3.2.1 精氨酸酶Ⅰ 患者特别是没有肝炎反应的慢性乙肝患者血清中L-精氨酸的含量比对照组要显著减少[24]。精氨酸酶Ⅰ可将L-精氨酸分解为L-鸟氨酸和尿素，在L-精氨酸的代谢中起重要作用。在肿瘤等疾病中已经显示出精氨酸酶Ⅰ是MDSCs抑制T细胞的重要机制之一[13,14]。

肝炎时gMDSCs在肝脏中聚集[4]。Gey等[25]用多名重病患者和健康对照人的血样测定精氨酸酶在gMDSCs和各种骨髓细胞亚群(mMDSCs和HLA-DR+单核细胞)中的含量，结果表明，gMDSCs中精氨酸酶含量很高，而mMDSCs和HLA-DR+单核细胞中精氨酸酶的含量很低。同时，发现血浆中L-精氨酸浓度与gMDSCs的数量有显著的负相关关系(P=0.013 7)，而与mMDSCs数量之间没有相关性(P=0.34)。gMDSCs中有很大比例表达精氨酸酶Ⅰ。这提示gMDSCs是精氨酸酶Ⅰ的主要来源。Laura等[4]通过对慢性乙肝患者肝活组织的检测发现， gMDSCs在肝内比在外周血中精氨酸酶Ⅰ和表面CD63表达量更高，CD63可以促进gMDSCs的脱颗粒反应及精氨酸酶Ⅰ的释放。这表明肝脏中gMDSCs有很强的分泌精氨酸酶Ⅰ的能力。由于精氨酸酶Ⅰ需要在碱性环境才可以维持较高的活性，在人体内会因为二价金属离子的快速丢失等原因缺乏稳定性，gMDSCs细胞质中的嗜天青颗粒(Azurophilic granules)会释放一种因子来活化精氨酸酶Ⅰ，从而保证其在体内中性环境稳定地执行全部功能[26]。

Ezernitchi等[27]发现在患慢性炎症的小鼠体内Gr1+Mac-1+MDSC可以使T细胞的CD3ζ表达量下降。Podriguez等[28]将T细胞在缺乏L-精氨酸的环境中培养，发现一段时间后TCR上的CD3ζ表达量减少，进一步研究发现精氨酸的缺乏使CD3ζ的mRNA转录速度和稳定性下降，从而使CD3ζ的mRNA数目减少，导致CD3ζ表达量的降低。由此可认为，MDSCs通过降解精氨酸来降低T细胞TCR上CD3ζ链表达量，从而抑制T细胞的功能。系统L氨基酸转运蛋白在TCR介导的T细胞增殖信号通路的代谢调节中有重要作用[29]。T细胞表面CD98的重链与系统L氨基酸转运蛋白形成异源二聚体，可以通过测定CD98的表达量来测定系统L氨基酸转运蛋白量。Laura等[4]分析CHB患者的血液和肝活组织内的T细胞发现，在肝脏中的T细胞以及HBV特异性的CD8+T细胞有更高的CD98表达量，通过体外实验也证明，处于L-精氨酸缺乏状态下，TCR受刺激的T细胞CD98的表达上调，转铁蛋白受体CD71表达量增加，苯丙氨酸吸收量骤增，显示出细胞代谢的改变。因此，gMDSCs通过分泌精氨酸酶导致L-精氨酸缺乏来使T细胞的增殖信号代谢改变。Paulo等[30]将正常人受抗原刺激的T细胞在缺乏L-精氨酸的环境中培养，发现T细胞的增殖量大幅下降。对这些T细胞分析后发现，这些T细胞细胞都停留在G0-G1期不再分裂，而对照组的细胞正常生长。补加入外源L-精氨酸后T细胞增殖恢复正常。精氨酸的缺乏也会使cyclin D3和cdk 4的mRNA转录速度下降，转录的mRNA稳定性降低，从而蛋白质表达量减少。Rb是D型cyclin/cdk酶复合体的底物，它的磷酸化是释放转录因子E2F-1以及细胞进入G1后期的关键。精氨酸的缺乏会使Rb磷酸化减少。此外，转录因子E2F-1入核是细胞进入S期的条件，缺乏精氨酸会使E2F-1几乎不能和对应的DNA结合。综上，在CHB中，gMDSCs分泌精氨酸酶Ⅰ大量消耗T细胞所必需的L-精氨酸，使得T细胞的增殖、代谢及信号转导受到抑制。

3.2.2 诱导性一氧化氮合酶 一氧化氮合酶主要由mMDSCs分泌[25]，可以将精氨酸转换成一氧化氮和L-瓜氨酸，因此，一氧化氮合酶的分泌对精氨酸的减少同样起一定的促进作用，此外inos还可以通过NO来行使功能。Zhu等[31]发现在肝炎小鼠的肝脏中大量表达的SSChighCD11bhighLy-6ChighLy-6GlowMDSCs 可以在体外抑制CD4+、CD8+T细胞的增殖和CD4+T细胞的功能，包括IFN-γ和IL-2的产生。进一步研究发现，加入inos的抑制剂N-(5-氨基-5-羧基戊)-乙脒(N6-(1-iminoethyl)-l-lysine)后，此类MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用消失。两种细胞共培养时，都表达inos，但SSChighCD11bhighLy-6ChighLy-6GlowMDSCs才是NO产生的主要来源。同时它们对CD4+T细胞作用是通过细胞间接触，将两种细胞隔开后抑制作用同样会消失。Roland等[32]也发现加入NO可以抑制Jak3和STAT5上酪氨酸磷酸化，从而封锁这一条信号通路，降低T细胞的增殖能力。

4 总结与展望

目前，针对CHB中免疫耐受机制的研究已经取得一定的进展，MDSCs在其中所起到的作用也逐渐清晰。然而还是有一些抑制T细胞免疫作用只观察到了现象，其内在的分子机制还不清楚，再加上MDSCs种类众多且在机体中分布广泛，给研究工作带来了一定的困难。由于MDSCs的作用是抑制机体的炎症反应[4]，所以可以通过抑制MDSCs来促进机体在感染的早期完全清除HBV，从而避免持续性的肝损伤，降低肝硬化甚至肝癌的可能性。Zhang等[33]已经发现，将雷帕霉素靶蛋白(mTOR)缺陷小鼠体内的MDSCs和正常小鼠体内的MDSCs分别转移到完全相同的肝损伤疾病的小鼠体内，mTOR缺陷的MDSCs表现出更强的增殖能力。这说明在与免疫相关的肝脏损伤类疾病中，mTOR会抑制MDSCs的增殖。同时，mTOR信号通路也可以抑制MDSCs一氧化氮合酶的表达和NO的产生。肝星状细胞和γδT细胞对MDSCs的免疫抑制有促进作用，也可以通过对这两种细胞的抑制来达到减弱MDSCs功能的作用[4,22]。同时也可以参考肿瘤中姜黄素和多烯紫杉醇通过促进MDSCs极化来抑制其聚集和调节功能的作用开展相关研究，尝试在CHB治疗中借鉴相似的方法[34,35]。随着对MDSCs在CHB中作用机制研究的深入，会有更多的机制被阐明，使我们更加了解在慢性抗原刺激的疾病中免疫相关的细胞增殖代谢调节，也为针对CHB和其他肝脏疾病的治疗带来了新的思路。

[1] Lok ASF,McMahon BJ,Brown RS,etal.Antiviral therapy for chronic hepatitia B viral infection in adults:A systematic review and meta-analysis[J].View Issue TOC,2016,63(1):284-290.

[2] Guidotti LG,Chisari FV.Immunobiology and pathogenesis of viral hepatitis[J].Annual Rev Pathol,2006,1:23-61.

[3] Nebbia G,Peppa D,Maini MK.Hepatitis B infection:current concepts and future challenges[J].Q J Med,2012,105(2):109-113.

[4] Pallett LJ,Gill US,Quaglia A,etal.Metabolic regulation of hepatitis B immunopathology by myeloid-derived suppressor cells[J].Nat Med,2015,21(6):591-600.

[5] Chen S,Akbar SMF,Abe M,etal.Immunosuppressive functions of hepatic myeloid-derived suppressor cells of normal mice and in a murine model of chronic hepatitis B virus[J].Clin Exper Immunol,2011,166:134-142.

[6] Huang A,Zhang B,Yan WW,etal.Myeloid-derived suppressor cells regulate immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection through PD-1-induced IL-10[J].J Immunol,2014,193(11):5461-5469.

[7] 张 浩，管世鹤，杨 凯，等.慢性乙型肝炎患者外周血CD14+HLA-DR-/low髓源性细胞的频数与炎症反应负相关[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(10):1387-1390.

[8] Nagaraj S,Youn JI,Weber H,etal.Anti-inflammatory triterpenoid blocks immune suppressive function of MDSCs and improves immune response in cancer[J].Clin Cancer Res,2010,16(6):1812.

[9] Poschke I,Kiessling R.On the armament and appearances of human myeloid-derived suppressor cells[J].Clin Immunol,2012,144:250-268.

[10] Movahedi K,Guilliams M,Van den Bossche J,etal.Identification of discrete tumor-induced myeloid-derived suppressor cell subpopulations with distinct T cell-suppressive activity[J].Blood,2008,111(8):4233-4244.

[11] Greten TF,Manns MP,Korangy F.Myeloid derived suppressor cells in human diseases[J].Int Immunopharmacol,2011,11:802-807.

[12] Hammerich L,Tacke F.Emerging roles of myeloid derived suppressor cells in hepatic inflammation and fibrosis[J].World J Gastrointestinal Pathophysiol,2015,6(3):43-50.

[13] Gabitass RF,Annels NE,Stocken DD,etal.Elevated myeloid-derived suppressor cells in pancreatic,esophageal and gastric cancer are an independent prognostic factor and are associated with significant elevation of the Th2 cytokine interleukin-13[J].Cancer Immunol Immunother,2011,60:1419-1430.

[14] Ochoa AC,Zea AH,Hernandez C,etal.Arginase,prostaglandins,and myeloid-derived suppressor cells in renal cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2007,13(2):721-726.

[15] Hoechst B,Ormandy LA,Ballmaier M,etal.A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces CD4+CD25+Foxp3+T cells[J].Gastroenterology,2008,135(1):234-243.

[16] Mundy-Bosse BL,Lesinski GB,Jaime-Ramirez AC,etal.Myeloid-derived suppressor cell inhibition of the IFN response in tumor-bearing mice[J].Cancer Res,2011,71(15):5101-5109.

[17] Tacke RS,Lee HC, Goh C,etal.Myeloid suppressor cells induced by hepatitis C virus suppress T-cell responses through the production of reactive oxygen species[J].Hepatology,2012,55(2):343-353.

[18] Sinha P,Clements VK, Bunt SK,etal.Cross-talk between myeloid-derived suppressor cells and macrophages subverts tumor immunity toward a type 2 response[J].J Immunol,2007,179(2):977-983.

[19] Liu C,Yu S,Kappes J,etal.Expansion of spleen myeloid suppressor cells represses NK cell cytotoxicity in tumor-bearing host[J].Blood,2007,109(10):4336-4342.

[20] Fang Z,Li J,Yu X,etal.Polarization of monocytic myeloid-derived suppressor cells by hepatitis B surface antigen is mediated via ERK/IL-6/STAT3 signaling feedback and restrains the activation of T cells in chronic hepatitis B virus infection[J].J Immunol,2015,10:1-10.

[21] Norris BA,Uebelhoer LS,Nakaya HI,etal.Chronic but not acute virus infection induces sustained expansion of myeloid suppressor cell numbers that inhibit viral-specific T cell immunity[J].Immunity,2013,38(21):309-321.

[22] Kong X,Sun R,Chen Y,etal.γδT cells drive myeloid-derived suppressor cell-mediated CD8+T cell exhaustion in hepatitis B virus-induced immunotolerance[J].J Immunol,2014,193:1646-1653.

[23] Suh YG, Kim JK, Byun JS,etal.CD11b+Gr1+bone marrow cells ameliorate liver fibrosis by producing interleukin-10 in mice[J].Hepatology,2012,56(5):1902-1912.

[24] Frumento G,Rotondo R,Tonetti M,etal.Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxygenase[J].J Exp Med,2002,196:459-468.

[25] Gey A,Tadie JM,Caumont-Prim A,etal.Granulocytic myeloid-derived suppressor cells inversely correlate with plasma arginine and overall survival in critically ill patients[J].Clin Exper Immunol,2014,180:280-288.

[26] Rotondo R,Bertolotto M,Barisione G,etal.Exocytosis of azurophil and arginase 1-containing granules by activated polymorphonuclear neutrophils is required to inhibit T lymphocyte proliferation[J].J Leukoc Biol,2011,89:721-726.

[27] Ezernitchi AV,Vaknin I,Cohen-Daniel L,etal.TCR ζ down-regulation under chronic inflammation is mediated by myeloid suppressor cells differentially distributed between various lymphatic organs[J].J Immunol,2006,177:4763-4772.

[28] Rodriguez PC,Zea AH,Culotta KS,etal.Regulation of T cell receptor CD3 ζ chain expression by L-arginine[J].J Biological Chem,2002,277(24):21123-21129.

[29] Sinclair LV,Rolf J,Emslie E,etal.Control of amino acid transport by antigen receptors coordinates the metabolic reprogramming essential for T cell differentiation[J].Nat Immunol,2013,14:500-508.

[30] Rodriguez PC,Quiceno DG,Ochoa AC.L-arginine availability regulates T-lymphocyte cell-cycle progression[J].Blood,2007,109(4):1568-1573.

[31] Zhu K,Zhang N,Guo N,etal.SSChighCD11bhighLy-6ChighLy-6Glowmyeloid cells curtail CD4 T cell response by inducible nitric oxide synthase in murine hepatitis[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,54:89-97.

[32] Bingisser RM,Tilbrook PA,Holt PG,etal.Macrophage-derived nitric oxide regulates T cell activation via reversible disruption of the Jak3/STAT5 signaling pathway[J].J Immunol,1998,160:5729-5734.

[33] Zhang Y,Bi Y,Yang H,etal.mTOR limits the recruitment of CD11b+Gr1+Ly6Chighmyeloid-derived suppressor cells in protecting against murine immunological hepatic injury[J].J Leukoc Biol,2014,95:961-969.

[34] Tu SP,Jin H,Shi JD.Curcumin induces the differentiation of myeloid-derived suppressor cells and inhibits their interaction with cancer cells and related tumor growth[J].Am Association Cancer Res,2011,10:205-214.

[35] Kodumudi KN,Woan K,Gilvary DL,etal.A novel chemoimmunomodulating property of docetaxel:suppression of myeloid-derived suppressor cells in tumor bearers[J].Am Association Cancer Res,2010,10:4583-4593.

[收稿2016-04-07 修回2016-04-27]

(编辑 许四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.033

①本文受东南大学教学改革研究项目(No.2015-120)资助。

李雪莹(1995年-)，女，主要从事固有免疫学方面研究，E-mail:609735042@qq.com。

及指导教师：沈宇清(1976年-)，女，博士，副教授，主要从事肿瘤免疫学方面的研究，E-mail:yuqingshenseu@qq.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)01-0152-04