蛋白质组学在常见神经退行性疾病中的临床研究进展

朱 蕾 徐仁伵

(南昌大学第一附属医院神经科，江西 南昌 330006)

·综述·

蛋白质组学在常见神经退行性疾病中的临床研究进展

朱 蕾 徐仁伵

(南昌大学第一附属医院神经科，江西 南昌 330006)

神经退行性疾病；蛋白质组学；阿尔茨海默病；帕金森病；亨廷顿氏病；肌萎缩性脊髓侧索硬化

神经退行性疾病是症状多样化的慢性神经系统疾病，常见的有阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿氏病(HD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)及许多其他不常见的、有功能障碍的疾病〔1〕。尽管已经证明基因突变与这些疾病密切相关，但大多数仍具有一定的年龄依赖性〔2〕。虽然神经退行性疾病起源不同，但神经退行性疾病都以神经元退化引起的进展性的运动、感觉、知觉及相关的认知和行为障碍为特征〔3〕。基因突变和外源因素共同导致神经退行性疾病的发生和进展，其发病机制复杂多样〔4〕。常见的神经退行性疾病相关的基因突变导致蛋白质错误折叠，病变蛋白质在大脑皮层、基底神经节、小脑、脑干及运动系统的神经细胞内形成蛋白质聚集和包涵体〔5〕。然而，导致蛋白质聚集的分子途径在很大程度上是未知的。尽管特定的基因异常会导致神经退化，但是遗传性的基因突变并不是神经细胞死亡的唯一原因，现有证据表明，外源性因素以及基因变异共同导致神经元细胞的死亡〔6〕。至今导致神经退化的根本机制目前是不明确的。本文就蛋白质组学在神经退行性疾病中的研究进展进行综述。

1 神经退行性疾病概述

不同的神经退行性疾病的症状、发病年龄和疾病进展特点各不相同，但是很多疾病在早期阶段经常出现类似的症状。

AD最常见的临床表现发生在生命的后期，但遗传性早发型AD也是被证实存在的〔7〕。淀粉样前体蛋白(APP)、早衰蛋白(PS)1及PS2与早发性家族型AD相关〔8〕。这些突变的基因导致细胞产生对神经元细胞具有毒性的β淀粉样肽(β-amyloid)42〔9〕。AD的神经病理特点是神经原纤维缠结(NFTs)和细胞外老年斑(SPs)。NFTs是微管相关tau蛋白(MAPT)过度磷酸化形式的〔10〕。SPs由多个蛋白质及β-amyloid与局部炎症反应形成的。NFTs与SPs导致神经退化的确切作用目前尚不清楚。进展的AD主要在海马体、大脑皮质区域的神经元丢失〔11〕。tau蛋白的突变也伴随着NFTs和17号染色体常染色体显性遗传的额颞叶痴呆(FTD)〔12〕。FTD是痴呆在所有年龄组有临床特征的第3个主要原因〔13〕。

PD是除了AD最常见的神经退行性疾病，特点是神经元多巴胺(DA)的缺失及黑质密部中形成的路易小体(LB)〔14〕。 PD大多是散发的，家族遗传型与Parkin(PARK2)、PINK1(PARK6)、DJ-1(PARK7)、α-synuclein(PARK1和PARK4)、泛素羧基端水解酶-L1基因(PARK5)和富亮氨酸重复激酶2(PARK8)突变有关〔15〕。在路易体痴呆(DLB)中，LB广泛表达于大脑皮质神经元亚群内〔16〕。

与PD相比，明确的家族史可以在本质上确定所有情况下的HD〔17〕。HD表现为DNA复制错误与亨廷顿蛋白基因的胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)三核苷酸重复序列动态突变发生病理性扩增引起多聚谷氨酰胺链异常延长导致的神经退行性疾病〔18〕。

ALS其特点是皮层、脑干和脊髓运动神经元功能损伤，由于细胞绉缩和轴突肿胀导致的神经元细胞广泛死亡〔19〕。不到10%的ALS为家族性，其中约10%～20%有超氧化物歧化酶(SOD)1基因突变，参与调节自由基的形成〔20〕。遗传研究表明，SOD1基因突变对运动神经元有选择性毒性作用〔21〕。

最后，还有一系列的早发型常染色体隐性疾病，主要影响下运动神经元，称为脊髓性肌萎缩，主要表现为进行性肌无力和肌萎缩。绝大多数脊髓性肌肉萎缩症患者运动神经SMN1基因缺失〔22〕。

2 蛋白质组学方法的概述

质谱法(MS)蛋白质组学的发展对多肽或蛋白质成分复杂的混合物的检测提供了有效帮助，使检测实验中蛋白质的灵敏度、准确度和速度有所提升〔23〕。MS还可以应用于不同样本之间的定性和定量的蛋白质差异的比较，尤其是发病组与未发病组。结合各种各样的蛋白质组学方法不仅可以分析蛋白质的特征，而且还可以分析细胞和生化通路，可以为神经退行性疾病生物学标志的发现和药物开发做出贡献。

功能蛋白质组学是专门收集蛋白质表达、转录后修饰(PTMs)和活动信息的研究方法，不仅仅是蛋白质鉴定，并且可以使我们对生物系统的功能有更全面的理解。功能蛋白质组学可以运用数学模型或其他生物学工具进行系统的生物化学分析〔24〕。随着MS技术的提升，可以结合MS与蛋白质微阵列技术来评估蛋白质之间的相互作用〔25〕。激酶组学是功能蛋白质组学的一个分支，主要涉及激酶的识别〔26〕，还可以识别激酶靶蛋白质，并阐明细胞通路〔27〕。

化学蛋白质组学是集生物化学、细胞生物学、有机合成和质谱于一体的学科〔28〕。这种方法为识别疾病潜在的生物学标记和药物靶点提供了机会。临床蛋白质组学，或称为平移蛋白质组学的目的是帮助疾病早期诊断、预测疾病进展、识别新的治疗靶点及评估治疗疗效〔29〕。氧化还原蛋白质组学是蛋白质组学的一个不断发展的分支，目的是识别和量化在病理条件下氧化的蛋白质，更好的理解蛋白质氧化〔30〕。不同的蛋白质组学方法适用于不同的神经退行性疾病。

3 蛋白质组学技术对神经退行性疾病的研究

3.1样品制备 蛋白质样品可以应用于各种目的，如下游识别、量化、功能研究。组织破坏有机械破坏或酶消化，组织破坏后，细胞已经溶解，即可提取蛋白质〔31〕。提取蛋白质的方法必须考虑到处理材料的数量和要使用的分析方法(电泳，色谱法，质谱法)。生物液体样品制备往往需要在质谱分析之前去除干扰成分及分馏。

3.2蛋白质分离 蛋白质分离方法基于电泳或色谱法。疾病的蛋白质表达，二维凝胶电泳(2-DE)与MS结合最常用〔32〕。在2-DE中，蛋白质混合物根据等电点(PI)在第一维度分离，根据分子量在第二维度分离，并使用多种可视化蛋白质染色方法。比较两个蛋白样品，由于蛋白质样品被不同荧光剂示踪，凝胶电泳(DIGE)的结果具有差异性〔33〕。由于各蛋白样本有不同的蛋白表达，被不同标记物标记的不同蛋白质混合物，可在同一张2-DE凝胶上进行蛋白质分离。除了电泳技术，各种依靠液相色谱法(LC)的无凝胶方法也可用于蛋白质或多肽的分离。LC在比较蛋白质组学中是可以从复杂混合物中分离出完整的蛋白质的重要方法〔34〕。多维蛋白质识别技术(MudPIT)是LC的重要扩展，由于不同固定相的分配系数不同可分离高度复杂的蛋白质混合物〔35〕。色谱质谱联用技术可以用于蛋白质自动识别、翻译后修饰(PTM)特性和蛋白质的量化。表面增强激光解吸/电离质谱技术(SELDI-MS)源自基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)，结合色谱法固相萃取及飞行时间质谱法(TOF-MS)检测蛋白质，可发现有诊断价值的特异蛋白质〔36〕。

3.3蛋白质识别和量化 由于高灵敏度和高选择性，蛋白质鉴定首选MS。质谱仪可分离和检测气相离子，因此必须使用不同的电离技术电离和蒸发分析物。常见的电离技术是电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)〔37〕。质量分析器利用电气或磁场将生成的气相离子分离。蛋白质鉴定中，首先利用肽链内切酶或胰蛋白酶消化蛋白质或蛋白质混合物，利用MS检测蛋白质消化产生的肽段，将得出来的实验序列与基因组序列数据库对应蛋白质理论序列对比。在蛋白质组学研究中需要测量某个生物样本中的相对或绝对质量。同位素标记定量法用于蛋白质的量化检测。细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)是基于MS的利用非放射性同位素检测样本中的蛋白质差异的技术。无标记定量方法是使用三级四极串联质谱的多反应监测(MRM)技术。这些方法将对疾病的发病机制及临床诊断提供有力的帮助。

4 蛋白质组学在神经退行性疾病中的应用

蛋白质几乎参与所有生物过程，可以作为疾病的有效的生物学标志。由于神经退行性疾病患者的脑组织很难得到，血液及脑脊液(CSF)较容易获得，多数时候利用神经退行性疾病患者体液进行相关研究。如Keeney等〔38〕使用氧化还原蛋白质组学确定各种神经退行性疾病包括AD和PD患者血清和CSF 中氧化的蛋白质。结果显示在AD和PD中载脂蛋白(Apo)A-1水平降低，ApoA-1受影响高度氧化变性形成4-羟-2-壬烯(HNE)，ApoA-1氧化可直接导致神经退化，ApoA-1可以作为有效的诊断标记物及药物治疗靶点。

4.1AD 最近LC-电喷雾离子化(ESI)-MS用来研究无症状和症状性家族性AD和晚发性AD CSF中PSEN1和APP蛋白表达的差异〔39〕。虽然56个蛋白表达有差异(46个表达上调和10个表达下调)，所有AD组CSF中各蛋白表达明显重叠。除了已经确定的AD相关蛋白，研究还发现许多独特的蛋白质包括calsyntenin-3、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPA)、4谷氨酸受体、CD99抗原、CTBS及磷分泌蛋白质1。Albertini等〔40〕最近使用SELDI-TOF-MS技术发现AD CSF 的 Aβ肽亚型。通过免疫蛋白组学发现散发的AD相比精神分裂症患者的CSF所有肽亚型均减少，15个不同Aβ肽亚型中Aβ1～42是唯一减少的，可以作为AD的生物学标志。Wijte等〔41〕应用样品制备方法对AD患者CSF行多肽分析，发现水解产生的内源性肽和多肽共价结合蛋白。VGF神经生长因子诱导蛋白和补体C4存在于自由肽部分，蛋白结合部分存在VGF神经生长因子诱导蛋白和α2-HS型糖蛋白〔42〕。为了评估多肽分析对早期AD的诊断，Jahn等〔42〕开发了一种新技术应用毛细管电泳质谱法识别AD的生物学标志，检测到CSF中1 104种低分子量肽存在。

4.2PD 为了更好地在分子和细胞水平了解PD的发病机制及诊断生物标志物，若干研究利用血液(全血、血浆、血清)和CSF行蛋白质组学分析。Zhao等〔43〕利用2-DE结合MS技术分析了中国PD组的血清蛋白质变化，15种蛋白质被检测出来，其中7种是PD的特异性蛋白质。分析表明，这些蛋白质很可能参与抗氧化作用、脂质代谢、细胞内转运、细胞增殖和免疫调节。Chen等〔44〕利用2-DE-MS技术对非PD组和PD组血浆行蛋白质组学分析。结果显示IgGκL和人类血清淀粉样蛋白(SA)P具有表达差异性，酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测出PD血浆中SAP浓度比非PD组显著提高，提示SAP可作为PD的生物学标志。

对PD组和对照组利用2-DE技术行CSF蛋白质组学差异分析，血清白蛋白、血红蛋白β片段、突变球蛋白、富含脯氨酸蛋白(PRR)14和血清转铁蛋白N端具有差异表达，这些蛋白可能导致神经功能障碍及PD的发病及进展〔45〕。无油凝胶蛋白质组学方法被用来识别和量化CSF中蛋白质和多肽。Zhang等〔46〕利用iTRAQ技术结合2D LC-MS/MS分析PD不同阶段的差异蛋白质组，结果显示26个不同的蛋白质，8个上调蛋白，18个下调蛋白质，这些蛋白质可能与氧化应激、线粒体功能障碍，蛋白质异常聚合和炎症有关。

由于某些蛋白存在于PD中，一些研究采用血液和CSF行蛋白质组学分析。如DJ-1蛋白质存在于常染色体隐性遗传PD及特发性PD中，已经被证实是人类CSF中的生物标志物〔47〕，且具有抗氧化和相关的神经保护作用〔48〕。早期的PD组和对照组之间的对照研究显示在PD组CSF中DJ-1水平降低，但在血浆中无显著差异〔49〕。Lin等〔50〕利用另外的114例样本进行了验证，建议把全血中的DJ-1亚型而不是总的DJ-1作为迟发型PD的生物学标志。

为了分析PD的生物学标志，可以应用先进的生物信息学和生物统计学软件包括Biomarker Wizard 3.1，Biomarker Patterns Software，Ciphergen 3.1 Biomarker Wizard与MS结合。这些软件通过定义识别模式和分类树来分类蛋白质。他们通过聚类分析自动检测质量峰值，使用适当的统计方法来计算峰值的灵敏度和特异性。灵敏度是区分出总疾病病例中准确分类疾病病例的能力，而特异性区分出对照病例总数中准确分类对照病例的能力。

4.3HD 关于HD生物液体中的生物学标志蛋白质组学研究并不多。Dalrymple等〔51〕尝试应用2-DE和MALDI-TOF 技术对HD组及对照组的血浆和CSF进行蛋白质组学分析，得出丛生蛋白是HD确定的生物学标志。Huang等〔52〕发现HD患者CSF中凝血酶原水平、ApoA-Ⅳ和结合珠蛋白表达升高，可以确定它们参与HD的发病机制，可作为HD的诊断生物学标记。

4.4ALS 基于蛋白质组学技术很少有ALS的生物学标志的发现。Ranganathan等〔53〕应用SELDI-TOF-MS和Subsequent biomarker wizard技术发现ALS CSF中甲状腺素运载蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制物C水平降低，神经内分泌蛋白7B2水平升高。Pasinetti等〔54〕使用类似的蛋白质组学方法，在ALS 患者CSF中验证了半胱氨酸蛋白酶抑制物C水平降低，并且发现了神经内分泌蛋白质VGF消化型片段的存在。最近应用2D-DIGE技术分别快速和缓慢进展的ALS患者和对照组的CSF行蛋白质组学研究，在快速进展型ALS的CSF中发现了6种上调蛋白质。除此之外，胎球蛋白A和甲状腺素运载蛋白也被证实可作为ALS的生物学标志〔55〕。

4.5其他神经退行性疾病 Constantinescu等〔56,57〕应用SELDI-TOF-MS技术对56例PD患者的CSF和非典型帕金森疾病患者(ADP)的CSF:包括42例帕金森叠加综合征(MSA)患者，39例进行性核上性麻痹(PSP)患者，9例皮质基底核变性(CBD)者和24例正常人的CSF进行蛋白质组学分析。泛素、β2微球蛋白和两种分泌粒蛋白1(嗜铬粒蛋白B)碎片在正常人和PD患者有差异性，但PD组和各APD对照组无明显差异性。

5 蛋白质组学对于神经退行性疾病的临床意义

神经退行性疾病是一类症状表现和疾病进展有明显异质性的疾病，甚至在相同的神经退行性疾病不同的疾病表型症状表现各异。由于生物学的异质性需要了解疾病的发病机制，预后标志物的识别比诊断标记物的识别来得容易，并且将对药物治疗改变疾病的进展产生巨大影响。预后标记物能够对高危患者进行早期预防，使得药物开发效率更高，成本更低。

综上，蛋白质组学与神经影像、临床数据的结合可以提高神经退行性疾病诊断的准确性，增强生物标志物的验证能力。蛋白质组学研究本身还存在许多缺点和不足，随着现代生物技术和信息技术发展，蛋白质组学研究将为病理机制、建立诊断标准、发现药物治疗靶点等方面做出更大的贡献。

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〔2016-08-19修回〕

(编辑 李相军)

R741

A

1005-9202(2017)19-4914-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.102

国家自然科学基金资助项目(30560042,81160161,81360198)

徐仁伵(1969-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事肌萎缩侧索硬化和帕金森病的发病机制和防治研究。

朱 蕾(1989-)，女，博士，主要从事肌萎缩侧索硬化的防治研究。