灰树花多糖协同顺铂对HeLa细胞凋亡的影响

解嘉志 王文硕 许岩松 邱 原 金海萍 吕冬霞

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

灰树花多糖协同顺铂对HeLa细胞凋亡的影响

解嘉志 王文硕 许岩松 邱 原 金海萍 吕冬霞

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

目的 探讨灰树花多糖(PGF)协同顺铂(DDP)对HeLa细胞凋亡的作用。方法 流式细胞仪测定不同药物处理组的凋亡率,苏木素-伊红(HE)染色观察凋亡细胞形态,免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3 蛋白表达。结果 流式细胞仪检测显示：PGF(0.05 mg/L)、DDP(1 mg/L)及联合组(PGF 0.05 mg/L+ DDP 1 mg/L)作用24 h凋亡率分别为21.28%、23.60%和42.13%，与空白对照组比较差异显著(P<0.05)，协同作用组与各单药组比较差异显著(P<0.05)；HE染色观察到凋亡细胞形态学改变；免疫组化显示，联合用药组与两单药组比较caspase-3 蛋白表达上调。结论 联合用药对HeLa细胞的凋亡率较单独用药组有明显提高，其作用机制可能与caspase-3蛋白表达上调有关。

灰树花多糖；顺铂；细胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

化疗药物在恶性肿瘤的治疗中起到非常重要的作用，但毒副作用也较大。研究表明，灰树花多糖(PGF)具有改善免疫系统功能、抑制肿瘤、调节血糖等功能〔1〕。本研究选用PGF联合顺铂(DDP)，研究其对HeLa细胞凋亡的影响，探讨PGF对DDP的增敏作用。

1 材料与方法

1.1 材料 小牛血清与RPMI1640培养液(杭州四季青),DDP(山东齐鲁制药)，PGF(浙江方格药业公司)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3 免疫组化试剂盒(天津索罗门生物公司)。超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS)，流氏细胞仪(美国BD公司)。HeLa细胞(武汉大学典型培养物冷藏中心)。

1.2 细胞培养与分组 使用RPMI1640完全培养液(含10%小牛血清)培养细胞。常规方法传代。前期研究显示0.05 mg/L PGF与1 mg/L DDP联合作用于24 h时点具有协同作用。分组：空白对照组：予含10%小牛血清的RPMI1640培养液；PGF组：PGF浓度为0.05 mg/L；DDP组：DDP浓度1 mg/L;0.05 mg/L PGF与1 mg/L DDP为联合用药组。

1.3 苏木素-伊红(HE)染色观察凋亡细胞 多聚赖氨酸处理盖玻片，将其置于6孔板中，以1×105个/ml接种，培养箱中培养24 h，加入药液，于24 h进行常规HE染色，在显微成像系统下观察结果。

1.4 流式细胞仪测定凋亡率 取对数生长期细胞加入药物，培养24 h后，采用磷脂结合蛋白Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。用无乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化、离心并收集细胞；冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次；400 μl的Binding Buffer悬浮细胞；加5 μl Annexin V-FITC于悬液中，2℃～8℃避光15 min后，再加Propidium Iodide 5 μl，混匀继续避光孵育5 min；1 h内进行流式细胞仪的观察和检测。

1.5 链霉亲合素-生物素复合物(SABC)免疫组化法检测caspase-3 蛋白表达 根据说明书检测caspase-3 蛋白表达。随机选取不重复的10个高倍视野(×400)观察 。镜下caspase-3表达阳性细胞为细胞膜和细胞质呈褐色或棕黄色，计算阳性细胞数量，并求平均值。

1.6 统计学方法 应用SPSS11.5 软件进行t检验。

2 结 果

2.1 HE染色观察凋亡细胞形态 倒置显微镜下观察染色细胞，与对照组比较，处理组呈现典型的凋亡形态：胞体小，皱而圆，核深染，质浓缩。

2.2 流氏细胞仪测定凋亡率 PGF组、DDP组及联合用药组凋亡率分别为21.28%、23.60%和42.13%，与对照组(1.18%)比较均有显著差异(P<0.05)；联合用药组与各单药组比较差异显著(P<0.05)。

2.3 免疫组化法检测caspase-3 蛋白表达 联合用药组(49.94%±3.73%)与两单药组(DDP组：35.23%±3.69%；PGF组：33.61%±3.35%)比较caspase-3 蛋白表达上调(P<0.05,P<0.01)，且均高于空白对照组(10.11%±1.67%，P<0.05)。

3 讨 论

本实验通过HE染色观察到典型的凋亡细胞。流式细胞仪检测结果提示PGF与DDP有协同作用，使HeLa 细胞对DDP的敏感性提高。研究提示，PGF联合DDP可明显增强抗肿瘤作用，对其作用机制的研究为临床PGF与DDP联用并作为化疗增敏剂治疗宫颈癌提供了新思路、新方法。

目前研究普遍显示，抗肿瘤药物大多数以诱导肿瘤细胞凋亡的形式杀死肿瘤细胞进而达到治疗目的〔2,3〕。引起细胞凋亡的因素很多，其中细胞凋亡是由一系列高度调控的caspase级联反应导致的结果已被普遍接受，认为细胞凋亡的核心执行者是caspase〔4,5〕。caspase家族中caspase-3是效应caspase〔6〕。细胞间的信号传递被caspase-3通过下游效应因子切断，并关闭DNA的复制与修复，破坏DNA的结构和细胞核，诱导凋亡小体的形成，进而执行凋亡功能〔7〕。

PGF、DDP单独应用可导致细胞中caspase-3表达增强，且协同作用时caspase-3表达增强更为明显。提示DDP与PGF促进细胞凋亡具有共同的途径，这可能是二者在一定时间及一定剂量时产生协同作用的机制。

1 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential〔J〕.Altern Med Rev,2001;6(1):48-60.

2 Wyllie AH,Kerr JF,Currie AR.Cell death:the significance of apoptosis〔J〕.Int Rev Cytol,1980;68(8):251-306.

3 Lee Y,Chong MJ,McKinnon PJ.Ataxia telangiectasia mutated-dependent apoptosis after genotoxic stress in the developing nervous system is determined by cellular differentiation status〔J〕.J Neurosci,2001;21(17):6687-93.

4 Rao RV,Hermel E,Castro-Obregon S,etal.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.Mechanism of caspase activation〔J〕.J Biol Chem,2001;276(36):33869-74.

5 Bradham CA,Qian T,Streetz K,etal.The mitochondrial permeability transition is required for tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis and cytochrome C release〔J〕.Mol Cell Biol,1998;18(11):6353-64.

6 Nicholson DW,Ali A,Thornberry NA,etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease nessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature,1995;376(6535):37-43.

7 Nicholson DW,Thornberry NA.Caspases:killer proteases〔J〕.Trends Biochem Sci,1997;22(8):299-306.

〔2016-02-17修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

国家自然科学基金面上项目(No.31471312)；黑龙江省自然科学基金面上项目(No.H2015074)；黑龙江省大学生创新创业训练计划重点项目(No.2016102220234)；佳木斯大学大学生创新创业训练计划重点项目(No.2016102220234)

吕冬霞(1965-)，女，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤发生机制与生物学治疗研究。

解嘉志(1991-)，男，在读本科，主要从事临床医学研究。

R730.52

A

1005-9202(2017)03-0531-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.004