双合汤含药血清促进BMSCs体外增殖的研究

段璋，周李学，李新建，李志敏，齐振熙

（1.福建中医药大学骨伤学院，福建福州350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350122）

·实验研究·

双合汤含药血清促进BMSCs体外增殖的研究

段璋1，周李学1，李新建1，李志敏1，齐振熙2

（1.福建中医药大学骨伤学院，福建福州350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350122）

目的观察双合汤含药血清对SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖的影响。方法采用全骨髓贴壁方法提取BMSCs，显微镜观察形态，流式细胞仪检测其表面标记物，计数法绘制其生长曲线，分别用低剂量、中剂量、高剂量10%双合汤含药血清代替胎牛血清（FBS）进行药物干预。结果培养的细胞以梭形为主，呈漩涡状生长；流式细胞仪检测CD34阳性率为0.96%，CD90阳性率为93.51%；生长曲线似倒S型；给药组的BMSCs增值速度比空白对照组均快，其中高剂量组增值速度最快。结论双合汤含药血清能促进BMSCs体外的增值速度，且高剂量双合汤含药血清促进BMSCs的增值速度最为明显。

骨髓间充质干细胞；全骨髓贴壁法；脂质代谢紊乱；激素；骨坏死；骨质疏松

干细胞是一类原始未分化，具有自我复制更新、高度和多方向分化的功能细胞［1］，它又分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs）和成体干细胞（adult stem cells，ASCs）。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是ASCs的一种，是除造血干细胞以外的非造血干细胞［2］，主要存在于骨髓中，约占骨髓单核细胞0.001%～0.01%［3］。因其取材方便，体外增值能力强，具有向软骨细胞、脂肪细胞等细胞分化能力［4-5］，为骨、脂肪等组织损伤的恢复提供细胞来源，又易转染、表达外源基因，在细胞、基因治疗中有着广泛的应用前景［6］，因此BMSCs的有效扩增显得意义重大。此次实验以SD大鼠为研究动物，采取全骨髓贴壁方法提取BMSCs，观察双合汤含药血清对BMSCs增值速度的影响。

1 材料

1.1 动物制备含药血清：2月龄SPF级健康SD大鼠16只，雄性，体重（200±10）g，分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、无含药组，每组4只。分离提取BMSCs：3周龄SPF级健康SD大鼠2只，雄性，体重（110±15）g。本实验动物均来自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（泸）2012-0002。

1.2 药物采用《中医内科学》［7］治疗痰瘀痹阻型痹症的双合汤：白芥子、姜半夏、陈皮、茯苓（去皮）、当归、川芎、白芍、生地黄各3 g，甘草、红花各0.9 g，桃仁（去皮）2.4 g，生姜3片。由北京康仁堂药业有限公司提供颗粒剂，用生理盐水自制成浓度为1 g·mL-1的制剂，密封保存备用。

1.3 试剂磷酸盐缓冲液（PBS，美国Hyclone公司，批号：NAA1322）；低糖培养基（L-DMEM，美国Hyclone公司，批号：NAC1349）；0.25%胰酶（含0.02% EDTA，美国Invitrogen公司，批号：1686946）；胎牛血清（FBS，美国Invitrogen公司，批号：1715752）；mouse lgG1（美国Biolegend公司，批号：B184124）；CCK-8（碧云天生物技术有限公司，批号：08010315 08）；CD34（美国Santa Cruz公司，批号：#J1014）；CD90（美国Biolegend公司，批号：B200112）；Goat anti-mouse lgG（美国Biolegend公司，批号：B180747）；10%水合氯醛溶液（北京雷根生物技术有限公司，批号：0529A15）。

1.4 主要仪器流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司，型号：BD FACSCaliburTM Flow Cytometer）；显微镜（德国Leica公司，型号：DMIL）；洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-1FD）；低速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：TDZ4A-WS）；CO2培养箱（美国SHEL-LAB公司，型号：3111）；Countstar自动细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司，型号：IC 1000）。

2 方法

2.1 双合汤含药血清的制备根据人体与动物药物等效剂量换算，按人体重60 kg，SD大鼠体重0.2 kg计算，3片生姜称得约3 g，再根据体表面积法计算：

等效给药剂量/g＝人体的剂量/（g·kg-1）×60 kg×S大鼠·S人-1≈0.62 g。

低剂量为3.1 g·kg-1，中剂量为6.2 g·kg-1，高剂量为12.4 g·kg-1。分别用低、中、高剂量双合汤溶液灌胃，并设为低、中、高剂量组。另设无含药组，用生理盐水1 mL/100 g灌胃，每天2次，连续7 d。在最后一次灌胃1 h后，用10%水合氯醛3～4 mL·kg-1腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，离心（3 000 r·min-1，15 min），吸出血清放入15 mL离心管中，置56℃恒温水浴箱30 min（灭活处理），再过滤（0.22 μL过滤器）除菌，-80℃保存待用。

2.2 SD大鼠BMSCs分离、传代培养及形态观察采用全骨髓贴壁法。取健康SPF级SD大鼠2只，用颈椎脱臼法处死大鼠，将大鼠浸入75%的酒精中5 min，然后将其移置紫外线消毒好的操作台中；取大鼠双侧股骨和胫骨并用手术刀刮除其表面的肌肉和骨膜，再放入PBS缓冲液中漂洗干净；用手术剪剪断两侧干垢端，用5 mL一次性注射器抽取5 mL含10%FBS的L-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，使冲洗液流至60 mm培养皿中，冲到骨髓腔发白；用移液枪缓慢吹打冲洗液数次并接种到2个25 cm2塑料培养瓶中，置入95%空气、5%CO2、37℃的培养箱中培养；第1天后半量换液（吸走2.5 mL培养液，再加2.5 mL新的完全培养液），3 d后全量换液（尽量将没贴壁细胞洗干净）；以后每3 d换液一次，直至长到80%左右（约10 d），进行传代；去培养液，PBS缓冲液洗2遍后每瓶加入1 mL预热的0.25%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA），室温静止消化；显微镜下见细胞变圆，少量细胞浮起时，立刻加入3 mL完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底，收集易消化的细胞悬液，离心（1 000 r·min-1，离心5 min）；倒掉上清液，加入完全培养基重悬，按1∶2接种到25 cm2塑料培养瓶中，每瓶接种4～6 mL，从培养到传代过程都在倒置显微镜拍照，观察细胞形态。

2.3 SD大鼠BMSCs的流式表型鉴定取生长良好的第3代BMSCs，待生长至90%融合时，用预冷的PBS缓冲液冲洗2遍，消化离心（1 000 r·min-1，5 min），弃清液，用预冷PBS清洗细胞1次；再离心，弃上清；用含0.1%BSA的PBS将细胞浓度调整为3×106mL-1，将细胞分装至1.5 mL的EP管中，每管100 μL；再按量于各个样品管内加入相对应异硫氰酸荧光素标记（fluorescein isothiocyanate，FITC）的一抗CD34、CD90，每组并设阴性对照组和同型对照组；阴性对照组不加任何抗体，同型对照组加FITC-mouse lgG1；小心吹打混匀，避光，室温静止30 min；往每样品管内添加适量1.5 mL PBS，吹打数次混匀，离心（1 000 r·min-1，5 min），弃上清；PBS重悬洗涤1次，弃上清；往各样品管内分别加入100 μL PBS，按量（参照抗体说明书）往各样品管内分别加入对应的二抗FITC Goat anti-mouse lgG，吹打混匀；避光，室温静止30 min，往每样品管内添加适量1.5 mL PBS，小心吹打混匀；离心（1 000 r·min-1，5 min），吸去上清液；最后往每管中加入300 μL PBS重悬细胞，装入检测管，通过流式细胞仪检测BMSCs细胞表面标志性抗原CD34、CD90阳性率鉴定大鼠BMSCs。

2.4 SD大鼠BMSCs生长曲线测定选取生长状态良好的第3代BMSCs细胞接种于24孔培养板，每孔1 mL，接种密度为1×1010mL-1，培养24 h后每日取3孔细胞消化计数，连续检测7 d（间隔时间24 h，允许误差5%）。7 d后用细胞计数仪自动绘制生长曲线。

2.5 不同药物浓度对SD大鼠BMSCs体外增殖活性分析选取生长状态良好的第3代BMSCs细胞，胰酶消化，重悬细胞，调整细胞密度，以2×103mL-1密度100 μL均匀接种于3块96孔板培养，且设加无含药血清的孔作为空白对照组，每组接种6个孔，进行培养（在37℃，5%CO2的条件下）6 h；向培养板中分别加入低、中、高剂量的双合汤含药血清与无含药血清的培养基各10 μL刺激；将培养板在培养箱分别孵育24、48、72 h；每孔加入10 μL或用培养基稀释1倍至20 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，会影响OD值的读数，外围一排孔加相应量PBS，并把培养板放在靠近培养箱水源的地方），在细胞培养箱内继续孵育3 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，如无450 nm滤光片，可以使用420～480 nm的滤光片，作为参考波长进行双波长测定。

2.6 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料属于正态分布的用单因素方差分析，非正态分布的用秩和检验；计数资料用卡方检验。

3 结果

3.1 BMSCs生长形态骨髓液刚接种于培养瓶时，悬浮着大小不一、圆型、折光性强的细胞于培养液中，如图1。24 h换液后可见部分贴壁细胞，呈单个散在或多个聚在一起的短梭形、多角形或星形细胞，如图2。9～10 d融合80%～90%，细胞呈典型的放射状排列、同心圆状集落生长，如图3。消化传代后，细胞24 h后完全贴壁，生长旺盛，2～3 d即可传代，如图4。继续培养仍能保持细胞形态及增值能力，至少能传10代。

3.2 流式细胞仪鉴定SD大鼠BMSCs表面标记物流式检测结果显示细胞均一性较好，表面抗原CD34阳性表达率为0.96%，见图5。CD90阳性表达率为93.51%，见图6。同型对照组的mouse lgG1阳性表达率均为1.17%。说明培养的SD大鼠细胞为BMSCs且纯度较高。

3.3 SD大鼠BMSCs生长曲线经过24 h的贴壁后，从图7可见，其生长似倒S型，前4 d为对数生长期，增值速度加快，第5 d开始进入平台期，增值速度减慢。

3.4 双合汤含药血清对BMSCs体外增殖活性的影响由表1可知，通过24 h、48 h、72 h的干预观察发现双合汤能促进BMSCs的增值且高剂量组促进BMSCs的增值最为明显。

4 讨论

分离获取BMSCs目前有多种方法可选［8-9］：全骨髓贴壁法操作过程简单，培养初期一定程度上保留了体内其生长环境，得到的细胞分化潜能较好，但细胞成分较复杂，均一性较差并且破碎的红细胞碎片可能对BMSCs生长有一定影响；密度梯度离心法操作过程较复杂，易引起细胞污染，但分离的细胞纯度较高；流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法过程复杂，实验条件要求高，骨髓量需求大，价格昂贵，对细胞损伤大，再加上未发现特异性很强的表面标记物，因此其应用受到限制［10］。林楚伟等［11］实验研究发现全骨髓贴壁培养法比密度梯度离心法所分离得到的细胞，其活力、增殖能力有明显提高，更适合下面的实验。本研究采用全骨髓贴壁培养法分离纯化的SD大鼠BMSCs呈长梭形、集落样、漩涡状生长，均匀地表达BMSCs表面标记抗原CD90，而不表达造血前体细胞标记抗原CD34，符合BMSCs的生物学特性，可以用于BMSCs相关研究。

表1 不同浓度双合汤含药血清对BMSCs体外增殖活性的影响

表1 不同浓度双合汤含药血清对BMSCs体外增殖活性的影响

注：与空白对照组比较，1）P＜0.01；与高剂量组比较，2）P＜0.05。

组别空白对照组低剂量组中剂量组高剂量组n 6 6 6 6 OD值24 h 0.3147±0.002 0.3310±0.0041）2）0.3430±0.0031）2）0.3645±0.0031）48 h 0.3717±0.004 0.3860±0.0041）2）0.3918±0.0021）2）0.4077±0.0071）72 h 0.6122±0.004 0.6423±0.0031）2）0.6650±0.0031）2）0.6952±0.0031）

BMSCs具有多种表面标志分子，如间充质、成纤维细胞及内皮细胞的表面标志分子，目前还无独有的标志分子，如表达表面抗原CD90、CD166及黏附分子CD44（HCAM）、CD54（ICAM-1），不表达CD34、CD45等造血干/祖细胞的标志物［12-13］。

双合汤是治疗痰瘀痹阻型痹症的经典方，临床疗效肯定。近年来，有关双合汤对BMSCs增值的影响尚未见报道。目前，影响BMSCs体外增殖的资料显示［10］：10%的FBS有助于其稳定生长，高浓度或低浓度的FBS均不利于其生长，低浓度FBS营养物质不够，高浓度FBS含有大量促进其分化的因子，加快细胞老化；传代密度按1∶2接种到25 cm2的塑料培养瓶比较合适，这可能和细胞间的相互接触抑制有关；细胞因子对BMSCs的促增殖影响，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等。本实验选择10% FBS培养基，1∶2比例传到第3代进行体外扩增实验，结果表明双合汤含药血清能促进BMSCs的增长，这可能和化痰活血药物对细胞因子的作用有关。

QuanCui等［14］认为长期使用激素会使脂肪细胞肥大及造血细胞变少，促进BMSCs向脂肪细胞分化，激素诱导的骨母细胞向脂肪细胞形成和脂质代谢紊乱在激素性骨坏死和骨质疏松中起主要作用。脂质代谢紊乱即高脂血症，中医学又称为“痰浊”。Boss等［15］又认为高脂血症会引起骨内微血管中出现脂肪栓子、血管内皮细胞发生损害、血流障碍、血管内凝血系统紊乱，中医学里又称之为“血瘀”证。采用双合汤即为临床解决BMSCs增值数量又可以针对“痰瘀”的症状治疗。对于本方治疗长期应用激素导致BMSCs成脂分化即脂质代谢紊乱的骨坏死和骨质疏松，其作用机制以及中药药理作用有待于深入研究，这为我们中药治疗激素性骨坏死和骨质疏松的新药研发奠定了基础。

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R285.5

：A

：1000-338X（2016）06-0036-04

2016-09-10

国家自然科学基金面上项目（81473705）

段璋（1988—），男，硕士研究生，研究方向：股骨头坏死的基础与临床研究。

齐振熙（1957—），男，博士，教授。E-mail：zxqi@fjtcm.edu.cn