益气活血方对大鼠慢性脊髓压迫后受损脊髓组织内SOD和MDA含量的影响

杨宇 夏建龙△ 陈刚 杨挺 蔡平

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中医院，江苏 南京 210046)

益气活血方对大鼠慢性脊髓压迫后受损脊髓组织内SOD和MDA含量的影响

杨宇1夏建龙1△陈刚2杨挺1蔡平2

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中医院，江苏 南京 210046)

目的 观察不同浓度的益气活血方对大鼠慢性脊髓压迫后受损脊髓组织内超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的影响。方法 60只SD大鼠，随机选取10只作为假手术组。其余50只造模，术后1 d根据脊髓功能评分将其分为：A组:造模后，以不同浓度的益气活血方进行灌胃；B组：造模后，以颈复康进行灌胃；C组：造模后，以生理盐水进行灌胃。连续灌胃4周后，采用ELISA方法测定大鼠受损节段中SOD和MDA含量。结果 不同浓度的益气活血方及颈复康颗粒均能显著增加大鼠受损脊髓组织内SOD的含量(P<0.05)；中药高浓度、中药中浓度以及颈复康颗粒均能显著降低MDA的含量(P<0.05)；中药低浓度也能降低MDA含量，但与NS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 益气活血方能有效提高受损脊髓组织细胞中氧自由基的清除率，促进脊髓功能的恢复。

益气活血方； 大鼠； 脊髓型颈椎病； 超氧化物歧化酶； 丙二醛

脊髓型颈椎病(cervical spondylotic myelopathy, CSM)是由于颈椎间盘退变及突出、椎体后缘及钩椎关节骨质增生、后纵韧带骨化、黄韧带肥厚或钙化导致脊髓受压、缺血，继而出现脊髓功能障碍的疾病。本病好发于中老年人，发病率为人群的10%～15 %,男性多见，常因天气变化、寒冷刺激、劳累等原因诱发。CSM属中医学中的“痹”“痿”等证范畴。益气活血方以圣愈汤为主方,原方出自《脉因证治·金疮》卷四，为著名医家朱震亨所创。导师在临床中以该方为基本方随症加减，灵活运用于治疗CSM并改善CSM术后的脊髓功能状态。益气活血方由黄芪、陈皮、甘草、桂枝、 羌活、丹参、茯苓、当归等14味中药组成，具有益气活血、利水消肿、通络止痛之功效，对治疗该病具有很好的疗效,且服用安全、方便。目前关于中药治疗CSM的临床研究已有很多,但从炎症及抗神经细胞凋亡机制来探讨防治CSM的报道较少。作者采用大鼠自体第七颈椎棘突椎间移植法制造大鼠脊髓压迫模型来观察益气活血方能否通过抑制氧自由基的表达及促进SOD的产生，达到抑制神经细胞的凋亡的目的，以期为益气活血方的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

黄芪、陈皮、甘草、桂枝、 羌活、丹参、茯苓、当归、蜈蚣、延胡索、地龙、独活、泽兰、葛根、生理盐水、酒精、碘伏、青霉素，均购自江苏省中医院；纯水；10 %水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：20140115)；颈复康(益丰大药房，批号：490283)；SOD和MDA试剂盒购于南京建成生物研究所并由其研究所代测。

1.2 动物

SD大鼠60只，雌雄兼备，体质量(200±2 ) g，由南京中医药大学实验动物中心提供，SPF级，许可证号: SCXK(京)2012-0001。

1.3 器械及仪器

刀柄、眼科剪、线剪、有齿镊、无齿镊、持针器、弯钳、1/10 000精度天平、直钳、剃毛机等均由南京中医药大学药理研究室提供；1 mL注射器、针、线、23号刀片、医用纱布、棉球均购自江苏省中医院。

1.4 样品制备

分别取中药材于江苏省中医院代煎，将煎好的中药按成人临床用药量的20倍换算为高浓度、10倍换算为中浓度、5倍换算为低浓度，在南京中医药大学药理实验室浓缩，中药高浓度浓缩至5.4 g(生药)·mL-1，中药中浓度将高浓度用纯水等倍稀释至2.7 g(生药)·mL-1，中药低浓度将中浓度用纯水等倍稀释至1.35 g(生药)·mL-1；用研钵将颈复康磨细之后，用纯水配制成0.17 g·mL-1； 用天平称取10 g水合氯醛，用100 mL纯水配制成10 %水合氯醛备用。

1.5 大鼠脊髓压迫模型

参考徐远坤等[1]的方法：随机选取10只大鼠为假手术组(只暴露颈椎椎板，不咬除椎板，不造成大鼠脊髓压迫模型)。其余50只均在10 %水合氯醛(0.4 mL·Kg-1)麻醉下，用剃毛机剃除大鼠颈后的毛，常规碘伏消毒、铺巾，取大鼠颈椎后正中切口长3～4 cm切开皮肤、皮下，暴露颈肩部肌群，找到第七颈椎棘突(所有颈椎棘突均可用手触及，最高突起处即是)，自下往上正中切开肌肉群向两侧牵开，沿棘突两侧以23号刀片剥离棘突上附着肌肉，即可暴露整个颈椎骨面；自第七颈椎棘突基底部离断第七颈椎棘突并取出，刮除骨面附着组织备用；自第七颈椎棘突往上找到第5或6颈椎椎板，咬除部分椎板，并取相应直径的第七颈椎棘突骨块植入椎间隙，以不出现松动为度，并尽量向椎管内嵌压，以出现上肢肌肉反射性抽搐为度，缝合肌肉、皮肤，肌肉注射青霉素8万U/只，术毕。青霉素连续肌注3 d，术前及术后均不必禁食。为了避免大鼠相互挤压造成的伤害甚至死亡，术后采取单笼喂养并任其自由活动。造模过程中由于麻醉剂量控制不精准导致大鼠死亡7只，3只可能是因为手术创伤太大从而导致全身衰竭而亡。

1.6 分组及给药

为保证大鼠受损脊髓由急性压迫转为慢性压迫，术后适应性观察2周，待大鼠伤口基本愈合后采取合笼喂养。为保证脊髓损伤轻与重的大鼠在每组中的数量相当，术后1d根据改进Rivaling的斜板实验的平均度数、Tarlov评分、BBB评分将其分为益气活血方高浓度组(54g·kg-1·d-1)、益气活血方中浓度组(27g·kg-1·d-1)、益气活血方低浓度组(13.5g·kg-1·d-1)组 、颈复康组(1.7g·kg-1)、NS组，益气活血方高、中、低浓度组以及颈复康组采用1 mL·100 g-1灌胃给药，NS组及假手术组灌服等量NS，每日给药1次，连续4周。

1.7 取材

取出受损组织后放进液氮中，后转入-70 ℃冰箱中保存，用时取出用于检测SOD、MDA的含量。

1.8 统计学分析

2 结 果

不同浓度的益气活血方及颈复康颗粒均能显著增加大鼠受损脊髓组织内SOD的含量，与NS组相比差异有统计学意义(P<0.05)；中药高浓度、中浓度及颈复康颗粒均能显著降低MDA含量，与NS组相比差异有统计学意义(P<0.001，P<0.05，P<0.01)；中药低浓度虽亦能降低MDA含量，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脊髓组织中SOD、MDA含量

注：与NS组比较,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

3 讨 论

研究表明，脊髓受压后缺血与缺氧导致某些内源性物质的激活,局部自由基蓄积, 使脊髓血管痉挛、闭塞,血流量进一步减少,水肿加剧,从而引起脊髓神经结构与功能损伤甚至变性坏死。在脊髓受压继发性损害的过程中,机体产生的氧自由基直接攻击生物膜中的不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化,形成MDA等脂质过氧化物。SOD能够直接清除氧自由基，避免活性氧的伤害。故组织中SOD含量的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度[2]。二者联合测定能间接反映氧自由基的含量及脂质过氧化反应的强度[3]。SOD是体内重要的抗氧化酶,通过自由基转化为过氧化氢,再由过氧化氢酶和谷胱苷肽过氧化氢酶变为水,是清除自由基的机制之一[4]。药理实验显示黄芪提取物(黄芪甲苷)具有非常好的抗氧化作用[5]，在体内缺血再灌注损伤[6]模型中，发现经黄芪甲苷灌胃后的动物体内SOD等抗氧化酶的含量增加，Bcl-2基因表达增加，而Bax基因表达下降，能明显抑制超氧离子的产生，减轻由超氧离子引起的细胞微结构损伤及组织损伤和坏死。当归在保护损伤神经及促进神经再生方面具有重要作用[7]，同时，它还具有抗辐射、抗氧化、抗衰老的作用[8]。丹参提取物具有较强的抗氧化活性,可作为一种新的自由基清除剂和天然抗氧化剂[9]，通过对超阴离子的清除作用来阻止生物膜的脂质过氧化,从而保护生物膜[10]。黄芪、丹参、当归等能直接扩张周围血管，明显改善微循环[11]；并能减轻神经水肿、炎症、出血、变性和脱髓鞘，从而促进神经组织的再生[12]。方中诸药合用，有明显增强氧自由基清除率以及改善CSM术后脊髓功能状态的作用。

本实验采用大鼠自体第七颈椎棘突椎间移植法制造脊髓压迫模型来观察不同浓度的益气活血方对受损脊髓内SOD和MDA含量的影响，结果显示益气活血方具有提高氧自由基清除率的功能。其机制有待于进一步深入研究。

[1] 徐远坤, 张燕，陈久毅. 大鼠脊髓型颈椎病动物模型初探[J]. 中国中医骨伤科杂志, 2007, 15: 19-21.

[2] 刘煌敏, 黄怀钧. 兴奋性氨基酸, 氧自由基与缺氧再灌注脑损伤关系的实验观察[J]. 卒中与神经疾病, 2000,7(2): 98-100.

[3] WiIon J X, Gelb A W. Free radicals, antioxidants, and neurologic injury: possible relationship to cerebral protection by anesthetics[J]. J Neurosury Anesthesiol, 2002, 14(1): 66.

[4] 施杞, 郝永强, 彭宝淦,等. 动静力平衡失调与颈椎病——颈椎病动物模型的实验研究[J]. 上海中医药大学学报, 1999(1): 52-56.

[5] Hu JY, Lu LG, Zeng MG, et al. Astragaloside Ⅳ attenuates hypoxia-induced cardiomyocyte damage in rats by upregulating superoxide dismutase-1 levels[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2009, 36(4): 351.

[6] 关凤英, 李红, 杨世杰. 黄芪甲苷预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡的保护作用及机制研究[J]. 中草药, 2010, 41(7): 1146-1150.

[7] 陈旭东, 赵四敏, 华新宇,等. 当归对宫内缺氧后新生大鼠大脑CA3区神经元及NMDAR1mRNA表达的影响[J]. 时珍国医国药, 2010, 21(9): 2182-2183.

[8] 李曦, 张丽宏, 王晓晓, 等. 当归化学成分及药理作用研究进展[J]. 中药材, 2013, 36(6): 1023-1028.

[9] 王研, 温新宝, 秦翠萍, 等. 丹参提取物体外抗氧化活性研究[J]. 西北农业学报, 2011, 20(11): 160-163.

[10] 郭岱琦, 杨雷, 王大平, 等. 丹参对脊髓损伤早期自由基影响的实验研究[J]. 中国微循环, 2005, 9(1): 38-40.

[11] 孙映君. 中药药理学[M].北京:人民卫生出版社, 2000:384.

[12] 徐孝麟. 参麦注射液的临床应用进展[J].中国实用医药, 2006, 1(4):43.

Effects of the PNQAB on the contents of SOD and MDA in damaged rats' spinal cord tissue of the chronic Spinal Oppression Model

YangYu1,XiaJianlong1*,ChenGang2,YangTing1,CaiPing2.

1.TheFirstClinicalMedicalCollege,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210023,Jiangshu,China. 2.JiangsuProvinceHospitalofTCM,Nanjing210046,Jiangshu,China.

Objective To observe the effects exerted on the contents of SOD and MDA in damaged rats' spinal cord tissue, exposed to Jinfukang and different concentrations of the PNQAB (the prescription for nourishing qi and activating blood), were surveyed and discussed in the chronic spinal oppression model.Methods 10 SD-Rats were used as the sham-operated group in this experiment selected randomly from the sixty subjects, fed with the normal saline within explosion of the vertebral lamina and free from oppression of the spinal cord. The remaining were applied to establish the rat's spinal oppression model by grafting the self 7th cervical vertebrae spinous process at the part of C4-5 or C5-6 intervertebral space, then divided into three groups based on the assessment results of the spinal cord function at the 1st day postoperatively, feeding with the PNQAB under different concentrations (Group A)，Jinfukang (Group B) and Normal saline (Group C), respectively. After were treated 4 weeks, all the rats were narcotized to get the specific spinal cord for the determinations of SOD and MDA.Results The results were shown that the PNQAB regardless of the concentration difference and Jingfukang particles can both increase the content of SOD in rats' damaged spinal cord tissues significantly (P<0.05), while the PNQAB under high/medium concentrations and Jingfukang particles can also notably decrease MDA content, but not for the PNQAB in low concentration.Conclusion The PNQAB can effectively enhances the scavenging rate of the reactive oxygen radicals in tissues of the damaged spinal cord, and promotes the recovery of the spinal cord function.

PNQAB； Rat； CSM； SOD； MDA

R-332

A

1000-744X(2016)08-0814-03

2015-11-02)

△通信作者， E-mail: drjlxia@aliyun.com