宫颈癌组织中细胞周期相关激酶的表达功能与化疗药物敏感性的关系

李亚林 廖鸿纯

(长沙医学院病理教研室，湖南 长沙 410219)

宫颈癌组织中细胞周期相关激酶的表达功能与化疗药物敏感性的关系

李亚林 廖鸿纯△

(长沙医学院病理教研室，湖南 长沙 410219)

目的 探究宫颈癌组织中细胞周期相关激酶(CCRK)的表达功能与化疗药物敏感性的关系。方法 收集不同发展时期的90例宫颈癌样本并从中提取出Caski细胞系，通过RT-PCR、Northern blot鉴定筛选最有效的细胞系克隆，建立稳定沉默CCRK的宫颈癌细胞系模型，化疗药物顺铂、5-氟尿嘧啶处理Caski细胞系，分别检测化疗药物处理前后的Caski细胞系的CCRK表达功能。结果 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的宫颈癌组织中CCRK蛋白表达量组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。随着宫颈癌临床分期的增加，CCRK表达的阳性率逐渐升高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的宫颈癌组织CCRK表达的阳性率组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)；采用5-氟尿嘧啶处理的宫颈癌Caski细胞样本CCRK阳性化疗药物敏感度为49.2%，采用顺铂的CCRK阳性化疗药物敏感度为62.7%，采用5-氟尿嘧啶+顺铂的CCRK阳性化疗药物敏感度为88.1%，三组间差异具有统计学意义(P<0.05)。采用5-氟尿嘧啶、顺铂及5-氟尿嘧啶+顺铂的CCRK阴性化疗药物敏感度差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 宫颈癌组织中CCRK的表达功能与化疗药物敏感性具有显著相关性，CCRK的表达能够为宫颈癌的临床诊断提供参考，并能为宫颈癌的化疗治疗提供指导与参考。

宫颈癌； 细胞周期相关激酶； 化疗敏感性

细胞周期相关激酶(cell cycle Related kinase，CCRK)是一种细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶(CAK)，在许多恶性肿瘤中均有明显的过量表达反应，因而成为多种恶性肿瘤的临床检查诊断指标之一[1-3]。目前已有较多关于多种恶性肿瘤组织中CCRK表达功能的研究，但宫颈癌组织中CCRK的表达功能及其与化疗药物敏感性之间的相关性研究尚不多见[4]。因此，笔者将采用流式细胞检测方法检测宫颈癌中CCRK的表达功能，并采用四甲基偶氮唑盐显色法(MTT)检测宫颈癌Caski及沉默CCRK的宫颈癌细胞系对化疗药物的敏感性，从而探索宫颈癌CCRK表达功能与化疗药物敏感性的相关性，为临床诊断与治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本材料

收集2013年1月至2015年6月间90例不同分期宫颈癌患者的宫颈癌组织标本作为研究对象，所有患者均经过病理检测已确诊。年龄31～74岁，平均(57.2±12.4)岁；肿瘤分期：Ⅱ期23例，Ⅲ期44例，Ⅳ期23例，所有患者均未接受化疗或放疗。将病理标本置于RNA酶抑制剂内并低温冷冻以备检测之用。

1.2 试剂与仪器

RNA inhibitor，美国Sigma公司；D-Hanks液，上海Sangon生物工程技术服务有限公司；即用型兔抗人Survivin多克隆抗体，美国Abcam公司；即用型鼠抗人CCRK单克隆抗体，加拿大BBI公司；DAB试剂盒，美国Sigma公司；PBS缓冲液，上海Sangon生物工程技术服务有限公司；NC膜，上海Sangon生物工程技术服务有限公司；顺铂，齐鲁制药有限公司，批号：H37021362；5-氟尿嘧啶，沈阳药大集团琦药业，批号：H21023380；MTT，晶美生物工程公司；流式细胞仪，美国Bacton Dickson公司；酶标仪，BID-RAD公司。

1.3 CCRK检测

将保存的宫颈癌病理样本经过研磨、分离、沉淀、溶解等处理后获得Caski细胞系标本，将上述细胞样本置于80%的冰乙醇内冷冻过夜。采用PBS缓冲液冲洗样本2～3次，加入0.25%的去污剂(Triton X-100)处理样本5 min，再次使用PBS缓冲液冲洗样本2～3次。采用1%的BSA稀释鼠抗人CCRK单克隆抗体，加入细胞样本中，置于4 ℃恒温下孵育12 h，使用PBS缓冲液冲洗样本，加入标有异硫氰酸荧光素(FITC)的羊抗鼠IgG抗体后置于室温避光环境下孵育30min，使用PBS缓冲液洗涤标本，再使用含有0.1%核糖核酸酶和10 μg/mL的碘化丙啶的PBS缓冲液室温避光环境下处理30 min。之后采用流式细胞仪进行样本分析，检测宫颈癌组织Caski细胞系中CCRK的表达情况[5]。

1.4 化疗药物敏感性检测

将宫颈癌组织Caski细胞系样本浓度配置为5×105～1×106/mL，接种到102孔板上，每个孔内加入90 μL的细胞悬液，其中6个孔为不加化疗药物的宫颈癌细胞悬液的阳性对照组，另外6个孔内为只有培养液的阴性对照组；其它90个孔加入化疗药物处理的细胞悬液样本。具体化疗药物处理如下：200 μg/mL的5-氟尿嘧啶(5-Fu)10 μL、100 μg/mL的顺铂(DDP)10 μL，在37 ℃、5%CO2环境下培养12 h；200 μg/mL的5-氟尿嘧啶10 μL+100 μg/mL的顺铂10 μL，在37 ℃、5%CO2环境下培养24 h。检测时在每个板孔内加入10 μL的5 mg/mL的MTT，在37 ℃环境下培养4 h，之后加入酸化异丙醇并充分混合后检测宫颈癌Csaki细胞系对化疗药物的敏感性[6]。每次加入药物后只进行本次检测，换化疗药物时需要重复上述操作。

1.5 观察指标

统计不同临床分期的宫颈癌组织Caski细胞系中CCRK的表达情况，记录Caski细胞系化疗药物敏感性，规定化疗药物对宫颈癌抑制率IR=(A实验组-A阴性对照组)/(A阳性对照组-A阴性对照组)×100%；以IR≥30%为对化疗药物敏感；IR<30%则表示对化疗药物不敏感，统计分析宫颈癌组织中CCRK表达与化疗药物敏感性的关系。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 不同分期宫颈癌组织中CCRK表达情况比较

流式细胞仪检测结果显示，分期不同的宫颈癌组织的CCRK蛋白表达水平亦不同，临床分期越高，CCRK蛋白的表达水平越高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的宫颈癌组织CCRK蛋白表达量组间比较有统计学意义(P<0.05)。随着宫颈癌临床分期的增加，CCRK表达的阳性率逐渐升高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的宫颈癌组织CCRK表达的阳性率组间比较具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同分期宫颈癌组织CCRK表达情况比较

2.2 宫颈癌组织中CCRK表达与化疗药物敏感性的关系

采用5-氟尿嘧啶处理的宫颈癌Caski细胞样本CCRK阳性化疗药物敏感度为49.2%，采用顺铂的CCRK阳性化疗药物敏感度为62.7%，采用5-氟尿嘧啶+顺铂的CCRK阳性化疗药物敏感度为88.1%，三组间相比差异具有统计学意义(P<0.05)。采用5-氟尿嘧啶、顺铂及5-氟尿嘧啶+顺铂的CCRK阴性化疗药物敏感度差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 宫颈癌组织中CCRK表达与化疗药物敏感性关系

3 讨 论

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发病率一直居高不下，甚至有逐年上升趋势[7]。据相关报道显示，我国每年因宫颈癌而死亡的病例人数多达5万，且患病人群逐渐向年轻化发展，因此必须加强对宫颈癌的预防与治疗意识，降低广大女性罹患宫颈癌的风险[8]。许多恶性肿瘤的发生与多种因素有关，除了受到外界环境的影响之外还会受到基因改变积累的影响。

CCRK是对细胞周期正向控制的关键因子，能够通过磷酸化剂激活细胞周期的重要细胞调节因子的活性，从而对细胞生物行为产生影响。有研究证实CCRK在多种恶性肿瘤组织中存在过量表达反应，因而可以反映细胞周期是否正常，为恶性肿瘤的临床诊断提供参考[9-10]。吴武佳等[11]对肝细胞癌组织中的CCRK表达进行了研究，认为CCRK对肝细胞癌的发展具有促进作用。邵泽伟等[12]研究了小细胞肺癌组织中CCRK的表达，认为化疗药物的使用能够影响CCRK的表达。本研究结果显示，不同分期的宫颈癌组织中CCRK蛋白表达水平是不同的，临床分期越高，其表达水平越高，随着宫颈癌临床分期的增加，CCRK表达的阳性率亦逐渐升高。此外，采用5-氟尿嘧啶处理的宫颈癌Caski细胞样本CCRK阳性化疗药物敏感度为49.2%，采用顺铂的CCRK阳性化疗药物敏感度为62.7%，采用5-氟尿嘧啶+顺铂的CCRK阳性化疗药物敏感度为88.1%，证实宫颈癌组织中CCRK的表达与化疗药物的敏感性具有显著的相关性。

本研究结果初步显示，宫颈癌组织中CCRK的表达与化疗药物敏感性具有显著相关性，CCRK的表达可能为宫颈癌的临床诊断和化疗提供一定的参考与指导。然而，由于样本数量有限，所获取的研究结果有一定的局限性，仍有待于后续深入探究宫颈癌组织中CCRK的表达与化疗药物的敏感性间的深层关系，为临床诊断与治疗宫颈癌提供参考。

[1] 谢旭,田野,谭广,等.细胞周期相关激酶的肿瘤机制[J].国际肿瘤学杂志,2013,40(10):739-741.

[2] 吴国清,郑爱红,邓海霞,等.细胞周期相关激酶在卵巢癌细胞中的亚细胞定位及其表达的意义[J].实用肿瘤杂志,2010,25(5):527-530.

[3] 黄菊,刘锦涛.细胞周期相关激酶在癌变过程中的作用[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,7(7):3084-3086.

[4] 黄菊.CCRK、pcdk2和cyclinE在大肠腺癌中的表达及临床意义[D]. 湛江:广东医学院,2013.

[5] Yang Y,Roine N,Mkel TP， et al.CCRK depletion inhibits glioblastoma cell proliferation in a cilium-dependent manner[J].EMBO reports,2013,14(8):741-747.

[6] An X,Ng SS,Xie D，et al.Functional characterisation of cell cycle-related kinase (CCRK) in colorectal cancer carcinogenesis.[J].European journal of cancer: official journal for European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) [and] European Association for Cancer Research (EACR),2010,46(9):1752-1761.

[7] 吴武佳.CCRK在肝细胞癌组织中的表达及其与HBx的关系[D].郑州:郑州大学,2013.

[8] 章静菲,王彤,武明辉,等.北京市1399例宫颈癌的流行现状及临床特点[J].中华医学杂志,2011,91(43):3058-3061.

[9] 马莉娟,何金彩,柴泽英,等.细胞分化抑制因子-1与细胞增殖核抗原Ki-67在宫颈癌中的表达及相关性研究[J].中国临床药理学杂志,2015,31(8):627-630.

[10] Phirke P,Efimenko E,Mohan S et al.Transcriptional profiling of C. elegans DAF-19 uncovers a ciliary base-associated protein and a CDK/CCRK/LF2p-related kinase required for intraflagellar transport.[J].Developmental biology,2011,357(1):235-247.

[11] 吴武佳,陈李影慧,宋晨源,等.CCRK在肝细胞癌组织中的表达及其与HBx的关系[J].军事医学,2013,37(2):110-113.

[12] 邵泽伟,山凤莲,孙炜炜,等.小细胞肺癌组织细胞周期相关激酶的表达及其临床意义[J].中国医师杂志,2015,17(3):343-346.

Correlation between the expression function of cell cycle related kinase (CCRK)in cervical cancer and the Chemosensitivity

LiYaling,LiaoHongchun.

DepartmentofPathology,ChangshaMedicalCollege,Changsha, 410219,Hunan,China.

Objective To explore the correlation between the expression function of cell cycle related kinase (CCRK)in cervical cancer and the Chemosensitivity. Methods Total of 90 patients with cervical cancer was collected and extracted Caski cell line from them to be researched. And the most effective cell line cloning was identified and screened by using RT-PCR, Northern blot to build a steady and silent CCRK of cervical cancer cell line model. The chemotherapeutic drugs Cisplatin and 5-fluorouracil was used to deal with Caski cell line. The expression function of CCRK of Caski cell line before and after the deal of chemotherapeutic drugs was respectively tested. Results There were statistical significantly differences in the protein expression of CCRK in cervical cancer of phase Ⅱ, phase Ⅲ and phase Ⅳ(P<0.05). As the growth of clinical stage of cervical cancer, the positive rate of CCRK expression was gradually increasing, and there were statistical significantly differences in the positive rate of CCRK expression of phase Ⅱ, phase Ⅲ and the phase Ⅳ(P<0.05). The CCRK positive chemosensitivity of Caski cell samples of cervical cancer used 5-fluorouracil was 49.2%, while it used Cisplatin was 62.7%. And the CCRK positive chemosensitivity of Caski cell samples of cervical cancer used 5-fluorouracil and Cisplatin was 88.1% and there were statistical significantly differences(P<0.05).Conclusion It has correlation between the expression function of cell cycle related kinase (CCRK)in cervical cancer and the Chemosensitivity, and the expression of CCRK can offer information guidance for clinical diagnosis and chemotherapy of cervical cancer.

Cervical cancer; Cell cycle related kinase; Chemosensitivity

湖南省教育厅资助科研项目(编号12C0501)

R737.33

A

1000-744X(2016)08-0801-03

2015-11-02)

△通信作者