骨化三醇注射液中甘氨酸含量测定方法研究

靳文仙，李艳贞，刘 欢，吴 赟，阎 卉，王成港

(天津药物研究院，天津 300193)

骨化三醇注射液中甘氨酸含量测定方法研究

靳文仙，李艳贞，刘 欢，吴 赟，阎 卉，王成港*

(天津药物研究院，天津 300193)

目的：建立HPLC法测定骨化三醇注射液中甘氨酸的含量。方法：采用柱前衍生高效液相色谱法测定，通过实验筛选出柱前衍生化的最佳反应条件。结果：衍生反应的最佳条件为pH 8.04，温度20～30 ℃，反应时间为1.5 min，试剂用量1 ml。含量测定的方法学验证结果显示该方法专属性好，线性关系、重复性、回收率较好。结论：采用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法能准确测定骨化三醇注射液中甘氨酸含量。

高效液相色谱法，柱前衍生，邻苯二甲醛，甘氨酸，骨化三醇注射液

甘氨酸(Glycine)又名氨基乙酸，常用于注射液中作为pH调节剂、缓冲剂、稳定剂等。为保证注射液质量，需要严格控制注射液中甘氨酸含量。

目前氨基酸的测定方法主要有柱后衍生离子交换色谱法、柱前衍生高效液相色谱法、阴离子交换色谱法、衍生化气相色谱法和毛细管电泳法等[1，2]。其中柱前衍生高效液相色谱法具有分离度高、选择性好等优点。常用的衍生试剂主要有邻苯二甲醛、二甲胺基偶氮苯、磺酰氯、氯甲酸、芴基甲酯、2,4-二硝基氟苯(DNFB)等[3，4]。本文采用C18柱，以邻苯二甲醛(OPA)为柱前衍生化试剂，采用高效液相色谱法，紫外检测器测定骨化三醇注射液中甘氨酸的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(LabAlliance series 1500系统，紫外检测器，自动进样器)。Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长为334 nm；流动相：0.02 mol/L乙酸胺水溶液(pH 5.5)-乙腈(70∶30)；流速1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.1.2 溶液配制

2.1.2.1 邻苯二甲醛反应液 称取0.1 g邻苯二甲醛置100 ml棕色量瓶中，加1 ml无水乙醇溶解，加入0.2 ml巯基乙醇，用0.2%硼酸钠水溶液定容，摇匀，避光保存(4 ℃冰箱可保存一周)。

2.1.2.2 磷酸盐缓冲液 分别配制浓度为1/15 mol/L的磷酸二氢钾溶液和磷酸氢二钠溶液。将磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钾溶液按1∶99、10∶90、60∶40、95∶5和99∶1比例混合，制备成pH为4.92、5.91、6.98、8.04和8.67的缓冲液。

2.1.2.3 对照品溶液 称取甘氨酸对照品适量，加水溶解配制成浓度为30 μg/ml的对照品溶液。

2.1.2.4 样品溶液 精密量取1 ml骨化三醇注射液置10 ml棕色量瓶中，加水定容至刻度。

2.1.3 样品测定 量取1 ml对照品溶液或供试品溶液置具塞玻璃管中，加入1 ml磷酸盐缓冲液(pH 8.04)、1 ml邻苯二甲醛反应液，振匀并准确计时，室温避光反应1.5 min后进样测定，按照外标法计算注射液中甘氨酸的含量。理论塔板数不应低于4 000，主峰与其他峰的分离度应符合要求。

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2.2 衍生条件的选择 衍生反应受反应试剂用量、反应时间、反应温度、溶液pH等条件的影响特别显著，因此需要严格控制反应条件，以保证测定方法的重现性。

2.2.1 衍生时间 甘氨酸与邻苯二甲醛的衍生物不稳定，容易降解。为了确保测定的准确性、重现性，需要确定二者的反应时间。按“2.1.3”项下方法制备衍生反应样品，准确反应0.5、1、1.5、2、3和4 min后测定，以衍生物峰面积作为指标，确定最佳反应时间。结果见表1。

表1 衍生时间的考查

由结果可知，0.5 min时衍生反应不完全，峰面积较低，反应时间为1和1.5 min时，衍生物峰面积无明显差异，此后衍生物峰面积降解迅速，因此确定样品的衍生时间为1.5 min，为保证该测定方法良好的准确性、重现性，每次衍生时间需要准确计时。

2.2.2 试剂用量 取3支具塞试管，分别加入1 ml甘氨酸对照品溶液和1 ml磷酸盐缓冲液(pH 8.04)，再分别加入0.5、1和2 ml 邻苯二甲醛反应液，分别用水补足至4 ml，摇匀并准确计时，反应1.5 min后进样测定，结果见表2。

表2 反应液用量的考查

由表2可知，加入以上不同量的邻苯二甲醛反应液，生成的衍生物峰面积没有显著差异，最终选择邻苯二甲醛反应液的用量为1 ml。

2.2.3 反应温度 将甘氨酸对照品溶液、邻苯二甲醛反应液、磷酸盐缓冲液提前放置于冰浴中(10 ℃)，在冰浴条件下按“2.1.3”项下方法制备衍生反应样品，准确反应1.5 min后测定。同法考查10、20、30和40 ℃时样品的反应情况。以衍生物峰面积作为指标，确定最佳反应温度。结果见表3。

表3 反应温度的考查

由表3可知，10 ℃时峰面积最小，说明衍生化反应速度较慢。由于衍生物不稳定，40 ℃时衍生物迅速降解，峰面积下降。反应温度为20～30 ℃时，衍生物峰面积最高，且二者无显著区别。因此衍生反应可在室温下进行。

2.2.4 溶液pH 取5支具塞试管，分别加入1 ml pH 4.92、5.91、6.98、8.04和8.67的磷酸盐缓冲液，再各加入1 ml甘氨酸对照品溶液、1 ml邻苯二甲醛反应液，摇匀并准确计时，反应0.5、1、1.5、2、3和4 min后进样测定，记录峰面积。结果见表4和图1。

表4 溶液pH值的考查

图1 溶液pH值的考查

从表4和图1结果可知，在酸性条件下，衍生反应迅速，但衍生物降解迅速，溶液稳定性较差。碱性条件下，衍生反应相对缓慢，溶液的稳定性较好。因此选择pH 8.04的缓冲液。

2.3 方法学考查

2.3.1 专属性 取流动相、邻苯二甲醛反应溶液，分别直接注入高效液相色谱仪中测定，记录色谱图；另取空白辅料溶液、对照品溶液、骨化三醇注射液按“2.1.3”项下方法制备衍生反应样品，进样测定。结果见图2，由图可知，流动相、反应溶液、空白辅料均不会干扰甘氨酸的测定，该方法的专属性良好。

1.甘氨酸

2.3.2 线性关系考查 称取25 mg甘氨酸置250 ml量瓶中，加水溶解，定容至刻度。分别取上述溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml至10 ml量瓶中，加水定容，制备成浓度为5、10、20、30、40和50 μg/ml的线性溶液。按“2.1.3”项下方法制备衍生反应样品，进样测定，以峰面积和甘氨酸浓度进行线性回归，求得回归方程为Y=20 120X+2 752.4(r=0.999 8)。结果表明，在5～50 μg/ml的范围内甘氨酸浓度与峰面积的线性关系良好。

2.3.3 重现性试验 照“2.1.2.3”项下的方法配制对照品溶液,按“2.1.2.4”项下方法配制6份样品溶液，分别进样，按照外标法计算注射液中甘氨酸含量，结果RSD为1.27%，重现性良好，符合要求。

2.3.4 回收率试验 称取甘氨酸适量，加水溶解配制成浓度为300 μg/ml的甘氨酸储备液。按照处方配制不含甘氨酸的空白辅料注射液，备用。取9只10 ml量瓶，各加入1 ml空白辅料注射液，再分别加入0.5、1.0和1.5 ml甘氨酸储备液，加去离子水稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，每个浓度配制3份。按“2.1.3”项下方法制备衍生反应样品，进样测定，采用外标法计算回收率，结果平均回收率为100.1%，RSD为1.85%。见表6。

表6 回收率试验结果

2.4 含量测定 取20141101、20141102、20141103批样品，按甘氨酸含量测定方法进行测定，结果见表8。

表8 骨化三醇注射液中甘氨酸含量测定结果

由表8可知，样品的甘氨酸含量均符合质量标准中的要求，即每ml注射液中含甘氨酸的量应控制在0.27～0.30 mg。

3 讨论

甘氨酸本身在C18柱中没有保留，无法进行色谱分离，并且不能采用紫外检测器或荧光检测器直接进行测定。经OPA衍生后，甘氨酸在β-巯基乙醇等试剂存在下与邻苯二甲醛迅速反应生成的1-硫代-2-烷基异吲哚衍生物，具有紫外吸收，可采用紫外检测器检测。这种衍生方法步骤简单，反应迅速，并且剩余试剂不干扰测定。但甘氨酸衍生后的产物稳定性差、见光易分解，因此样品制备过程中需要避光操作，每次临进样时才加入衍生试剂。

方法学验证结果表明，该方法专属性好，线性关系、重复性、回收率较好。因此，采用OPA柱前衍生高效液相色谱法能准确测定骨化三醇注射液中甘氨酸含量。并且，液相色谱仪的应用广泛，此方法更易于推广和应用，具有较高的使用价值。

1 丁永胜,牟世芬.氨基酸的分析方法及其应用进展[J].色谱,2004,22(5):210-215

2 戴红，张宗才，张新申.氨基酸分析的检测方法评述[J].皮革科学与工程,2004,14(3):39-43

3 张琳，平贵臣，于晓明,等. 氯甲酸-9-芴甲酯柱前衍生脂肪胺类化合物的反相高效液相色谱分析[J].现代仪器,2004,10(2):14-16

4 李东，孙家义.2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法测定18种氨基酸[J].化学分析计量,2004,13(1):18-20

Determination of glycine in calcitriol injection

Jin Wenxian, Li Yanzhen, Liu Huan, Wuyun, Yan Hui, Wang Chengang

(Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193)

Objective: To establish a method for determination of glycine in calcitriol injection. Methods: An optimized condition for pre-column derivation of glycine in calcitriol injection was explored and then the derivative of glycerine was quantitatively determined by high performance liquid chromatogrphy. Results: Glycerine was best derivatized with one millimetre at pH 8.04，the reaction temperature of 20～30 ℃ and the reaction time of 1.5 min. The determination method was validated in a good specificity, linearity, reproducibility and recovery. Conclusions: The method can be used for the determination of glycine in calcitriol injection.

IHPLC，pre-column derivatization， o-phthalaldehyde，glycine，calcitriol injection

2016-05-06

*通讯作者：王成港：E-mail：wangcq@tjipr.com。

R927.2

A

1006-5687(2016)04-0019-04