结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关基因研究进展

曹志敏，陈 玲

结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关基因研究进展

曹志敏，陈 玲

吡嗪酰胺是治疗结核病的重要抗结核药物之一，特别是用于耐多药结核病的治疗。近年来结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的耐药逐渐增多，其耐药机制尚未明确。本文针对结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药及其与基因变异之间的关系研究进展进行综述，以供研究者参考。

结核分枝杆菌；吡嗪酰胺；基因变异；耐药机制

吡嗪酰胺 (pyrazinamide，PZA)，又名异烟酰胺，为烟酰胺结构类似物，具有独特的灭菌活性，酸性条件下可杀灭处于半休眠期结核菌和持留菌，而其他抗结核药物却难以做到[1-2]。吡嗪酰胺抗结核疗效显著且与其他抗结核药物联用可缩短抗结核化疗周期，故被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐用于药物敏感的结核病及耐多药结核病的治疗[3-4]。近年来结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)对PZA耐药逐渐增多，研究报道在所有结核病中其1耐药率约为16.2% (95%CI11.2-21.2)[5]，且认为其耐药性的产生可能与细菌对利福平获得性耐药有关[6]。2016年全球结核病报告显示在对利福平敏感的菌株中0.5%～4.2%的菌株对PZA耐药，对利福平耐药的菌株中36.7%～81.3%的菌株对PZA耐药[4]，在具有耐多药结核病(Multidrug resistance tuberculosis，MDR-TB，指结核分枝杆菌至少同时对异烟肼和利福平耐药) 高风险的结核病患者中，结核分枝杆菌对PZA的耐药率为41.3% (95%CI29.0-53.7)，在MDR结核分枝杆菌中PZA耐药率达60.5% (95%CI52.3-68.6)，而在非MDR结核分枝杆菌临床分离株中PZA耐药率则为5%左右[5,7]。目前MTB对PZA耐药的机制尚不完全清楚，随着结核病疫情的加重及耐药结核病出现及传播，MTB对PZA的耐药机制已备受关注。

目前多数研究认为PZA耐药主要与MTB的某些基因变异后引起细菌对吡嗪酰胺的处理能力降低及细菌物质代谢改变等有关，如pncA、rpsA及PanD等基因。此外，也有文献报道其他基因如脂肪酸合成酶I(FAS-I)基因、长链脂酰辅酶A连接酶D2编码基因及嘧啶合成相关基因等变异也可能与MTB对PZA耐药有关。现将目前文献已报道的可能与PZA耐药产生有关的相关基因情况简述如下。

1 pncA基因

pncA基因全长为561 bp，仅编码186个氨基酸，但其突变位点繁多、复杂。目前大多数研究认为MTB对PZA耐药主要与细菌pncA基因变异有关[8]，早前有文献报道PZA表型耐药与pncA基因变异的相关性约达85%左右[3]。PZA与其他抗结核药物不同，必须在酸性环境中才能发挥强的抗菌活性，且其活性随细胞内pH值的降低而增强。PZA通过被动转运的方式进入MTB细胞内，被细菌细胞内吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase，PZase，由MTB的pncA基因编码)水解活化成其活性形式吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)并在细胞内蓄积，从而发挥强的抗结核作用[1,9]。pncA基因二级结构上有明确的PZase活性中心和金属离子结合位点，以其为基础将该基因分为3个部分，包括4个α区(α1-α4)、6个β区(β1-β6)及10个L区(L1-L10),其中PZase活性中心主要分布在L2、L7区域，L4为金属离子结合位点区域，两者均为对酶活性影响较大的区域且基因突变发生率较高，靠近这些位点的基因突变对酶活性的影响较具远离这些区域位点的突变大[10]。目前为止，研究报道pncA基因突变类型已达270多种，在72%～97%的吡嗪酰胺耐药菌株中，其突变位置散在分布于基因上游调控序列及下游序列的多个位置，但在整个pncA全基因中尚未发现与耐药密切相关的特定的“热点区域”[1,9,11]。

吡嗪酰胺酶由MTB的pncA基因编码，当结核分枝杆菌pncA基因变异后，可引起吡嗪酰胺酶蛋白结构不稳定和活性改变，从而丧失了将PZA有效转化为POA的能力，引起MTB对PZA耐药，研究发现对PZA耐药的MTB菌株其吡嗪酰胺酶活性常常降低或丧失，这可能是MTB对PZA耐药最主要的分子机制[9,12]。pncA基因突变形式以单核苷酸多态性(碱基置换)为主，也包括少数碱基缺失或碱基插入引起的移码或整码突变[9]。结核分枝杆菌PZA耐药相关因素的多中心研究中，对pncA基因突变位点与PZA耐药的关系进行风险评估，将其分为高度与PZA耐药相关、与PZA耐药相关性不清楚及与PZA耐药无明显相关性等3类，发现启动子区域的突变A-11G(C)、T-7G及pncA基因编码区中T2C、T17C、G19T、A29C、C102A、T104C、A146C、A152G、C174G、T192G、C211T、A226C、A286G(C)、T307G、C309G、C312A、G373T、390+G(G)、A403C、T416G、G463A、T490C、A523G等位点与结核分枝杆菌对PZA耐药相关具有高度相关，其中以启动子区域A-11G最常见，并认为该位点的突变可能与影响细菌蛋白质的合成和细胞核糖体对mRNA的结合等过程有关，而A188C、A460G等位点的变异是否与结核分枝杆菌PZA耐药有关尚不清楚[13-15]；A146C位点的突变则与PZA耐药无明显相关性[16]。近年来有研究在高水平PZA耐药(MIC>500 mg/L)的MTB临床分离株中检测到pncA基因变异主要集中在51-76、130-142及163-180三个编码区，而在94-97、11-16两个区域内也有相关MTB菌株呈低水平PZA耐药(MIC≤500 mg/L)[11]。尽管多数研究认为pncA基因变异是MTB对PZA耐药的主要原因，但并不是所有PZA耐药菌株都会发生pncA基因突变。研究发现3%～28%的PZA耐药菌株却无该基因变异，且有些发生突变的菌株仍可检测到PZase活性，提示可能该突变不能或不足以使PZase活性改变，也有研究在对PZA敏感MTB菌株中检测到pncA基因变异[1-2]。此外，因吡嗪酰胺发挥抗结核活性对酸性条件实验要求使得药物敏感试验困难，可能出现假阳性耐药或者假阴性敏感等，亦可能还存在其他的耐药机制。

2 rpsA基因

rpsA基因全长1 446 bp，编码长为481个氨基酸的30S核糖体蛋白质S1(RpsA)，研究认为该蛋白是POA的新型作用靶点，可能与MTB对其耐药性产生有关。有研究在PZA低水平耐药的MTB临床分离株DHM444中检测到在rpsA基因靠近C端的438位点存在3个碱基GCC的缺失(编码丙氨酸)，而该菌株却未发现pncA基因变异[17]。RpsA在细菌的“蛋白质翻译”过程中起重要作用，POA通过与有活性的RpsA结合来干扰MTB的“反式翻译”过程，从而影响细菌蛋白质的合成，发挥灭菌作用，且rpsA基因的表达水平与MTB生长速率、停止细菌生长的重要条件及下调细菌RpsA蛋白表达量等有关，当rpsA基因过表达时，细菌转化的POA不能与RpsA有效结合，影响MTB蛋白质的合成而对其产生耐药，这也有助于解释了为什么MTB处于饥饿状态、酸性pH、缺氧及能量抑制等情况时可以增强PZA的活性[17]。有学者通过对比PZA耐药菌株和敏感菌株的rpsA基因突变率时发现在3株耐药菌株中发现3′羧基末端出现单位点突变，分别为R474L、R474W和E433D，在1株敏感菌株也出现Q162R单位点突变，比较耐药菌株和敏感菌株的rpsA基因突变率时发现两者无统计学差异，认为可能与实验菌株样本量较小有关，rpsA的低突变率提示其可能不是PZA耐药的常见机制。虽有相关文献报道rpsA基因靠近C端438位点丙氨酸的缺失可影响POA与RpsA的结合[17]，但该基因中是否存在与PZA耐药相关的特定突变位点及突变类型目前相关文献报道很少。近年来也有研究认为rpsA基因突变可能与PZA耐药无关[12,16]，关于rpsA基因与PZA耐药的关系，还期待更多的研究。

3 panD基因

结核分枝杆菌panD基因全长420 bp，编码天冬氨酸脱羧酶(139个氨基酸)，该酶与泛酸盐和辅酶A合成所必需的β-丙氨酸合成有关，而泛酸盐和辅酶A对维持MTB生存具有重要作用，研究认为POA可能通过抑制泛酸盐和辅酶A合成来干扰细菌多方面的新陈代谢功能，如能量代谢及脂肪酸的生物合成等，从而发挥抗菌作用，但具体机制仍待进一步研究[18-19]。有研究通过对无pncA基因和rpsA基因变异的PZA耐药菌株进行全基因组测序分析发现存在panD基因突变，此外，也有研究发现通过诱导MTB的panD基因过表达可提高细菌对POA抵抗性，并发现β-丙氨酸和泛酸盐也具有拮抗POA的抗结核活性，这些发现都提示了panD基因突变可能与MTB对PZA耐药有关[12,19-20]。近来有研究发现在panD基因非活性位点H21R、I49V的突变导致了MTB对PZA耐药[21]，但目前panD基因突变与MTB对PZA耐药的具体关系及其作用机制仍尚未确切阐明，还需进一步研究。

4 FASI基因与fadD2基因

脂肪酸代谢在MTB的生存中占有重要地位，有研究报道靶向抑制MTB脂肪酸代谢相关功能，有明显改善PZA抗结核活性的潜力[22]。脂肪酸合成酶I(fattyacidsynthase, FAS)由脂肪酸合成酶I基因编码，在细菌脂肪酸合成代谢中其重要作用，POA可能通过抑制FASI活性而扰乱细胞膜电位及干扰细胞能量代谢，从而发挥对MTB较弱的杀灭能力[23]。但有研究表明FASI的活性可被POA一系列的类似物，如5-氯-吡嗪酰胺等抑制，而不能直接被POA抑制，提示该酶可能不是POA直接的药物靶标或者并不是其真正的靶标[24-25]。目前关于FASI基因突变与PZA耐药性关系相关文献报道较少，还待更深入的研究。

fadD2基因全长1 683 bp，为长链脂酰辅酶A连接酶D2(Long-Chain Fatty Acyl-CoA Ligase D2，FadD2 )的编码基因，有研究报道FadD2与MTB对PZA或POA的固有耐药有关，并发现在pH为中性的培养条件下，相对于对PZA高度耐药的野生型MTB，FadD2丧失功能的MTB突变体却对PZA敏感，提示可能与FadD2丧失功能后促进了MTB对PZA或POA敏感性升高有关。目前文献报道FadD2在细菌辅酶A和脂质代谢起核心作用，但在PZA固有耐药产生中的确切机制仍尚不清楚[22]。

尽管PZA耐药与MTB基因突变密切相关，但在PZA耐药的MTB临床分离株中，尚有部分菌株并未发现上述基因的变异，对于这部分菌株可能存在其他基因变异或其他耐药机制[18], 如药物外排泵机制、PZA摄取障碍机制及其他原因引起的耐药等。

5 展 望

目前对PZA作用机制及其耐药机制研究已取得一定的进展，但仍缺乏全面深入的了解，还需不断的探索和研究。大多数研究认为基因突变是MTB对PZA耐药的主要分子机制，其中pncA基因突变引起PZA耐药观念已达成共识，但具体的作用及耐药机制仍需更深入的研究；rpsA基因突变与PZA耐药性的产生有关的观点受到了质疑，待进一步研究证实；panD基因突变与耐PZA结核病有关，但其具体的关系及与PZA相互作用机制仍缺乏充分的实验数据支撑，需更广泛深入的研究；其他基因如FASI基因、fadD2基因及嘧啶合成相关的基因等相关研究较少，对其认识尚处于初步探索阶段。此外，研究提示MTB对PZA耐药还存在其他机制，如药物外排泵机制、PZA摄取障碍机制、其他未知基因变异及尚未发现的耐药机制等。目前耐药结核病的出现及传播已引起广泛关注，相关研究也陆续开展，随着科学技术的不断进步及创新，相信吡嗪酰胺的作用及耐药机制将会被阐明，同时也将会出现更安全、准确、快速、经济、简便的耐药性检测技术，为结核病及耐药结核病的诊断提供更科学有力的支撑。

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ResearchprogressofassociationbetweengenemutationandpyrazinamideresistanceinMycobacteriumtuberculosis

CAO Zhi-min, CHEN Ling

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

Pyrazinamide (PZA) is an important anti-tuberculosis drug especially for treating multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB). In recent years, the incidence ofMycobacteriumtuberculosis’ resistance to pyrazinamide has increased. At present, the mechanism of drug resistance has not been clearly elucidated. In this review, the association between gene mutation and pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosiswill be summarized.

Mycobacteriumtuberculosis; pyrazinamide; gene mutation; drug resistance mechanism

Chen Ling, Email: lingjuncd@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.015

国家自然科学基金(No.81360002)资助

陈 玲,Email：lingjuncd@163.com

遵义医学院附属医院呼吸二科，遵义 563000

R378

A

1002-2694(2017)10-0923-04

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360002)

2017-02-15编辑李友松