奶牛乳房炎病原检测技术研究进展

刁巧虹，卞国志，王 娟，罗蔼剑，张 莹，高潇祎，袁建丰，孙凌霜

（1.广东海大畜牧兽医研究院有限公司，广州 511400；2.广东海大集团股份有限公司，广州 511400；3.华南农业大学兽医学院，广州 510642）

·综述·

奶牛乳房炎病原检测技术研究进展

刁巧虹1,3，卞国志2,3，王 娟1,2，罗蔼剑3，张 莹3，高潇祎3，袁建丰1,2，孙凌霜3

（1.广东海大畜牧兽医研究院有限公司，广州 511400；2.广东海大集团股份有限公司，广州 511400；3.华南农业大学兽医学院，广州 510642）

奶牛乳房炎是危害奶牛业最重要的疾病之一，不仅给奶牛业造成了巨大的经济损失，而且其某些病原体可引起人类感染。引起奶牛乳房炎的病原多达150种，及时、准确的诊断乳房炎并检测出致病菌，对奶牛乳房炎的综合防治有着重要意义。目前，检测乳房炎病原的方法主要有细菌分离鉴定法、免疫学检测法、基因芯片和PCR检测技术等。本文就奶牛乳房炎病原检测技术进行系统阐述，旨在为奶牛乳房炎的综合防治提供参考。

乳房炎；病原；检测技术；奶牛

奶牛乳房炎是危害奶牛业最重要的疾病之一，不仅能引起产奶量及其品质下降，造成严重的经济损失，而且患病奶牛所产牛奶中的某些病原体可引起人类感染。中国大部分地区奶牛乳房炎的检出率在50%以上，而引起奶牛乳房炎的病原有细菌、病毒、真菌、支原体和绿藻等150多种。调查显示最常见的致病菌有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和酵母菌等[1-3]。根据临床表现可将奶牛乳房炎分为隐性型乳房炎和临床型乳房炎。常用的诊断方法有体细胞直接计数法、CMT检测法、黏度测试法、DNA含量测定法、ATP生物发光法技术、乳汁电导率的测定、乳汁pH值测定、乳成分直接检测和MTT检测法等，但是这些诊断方法都不能直接检测出病原体的类型，难以对乳房炎的治疗和预防提供及时确切的参考。目前能检测乳房炎病原的方法主要有细菌分离鉴定法、免疫学检测法、基因芯片和PCR检测技术等。

1 乳汁中致病菌分离鉴定法

乳汁中致病菌的分离鉴定是传统的奶牛乳房炎的诊断方法，主要包括无菌采集待检乳样，使用分离培养基和生化培养基进行分离鉴定，涂片染色、镜检和药敏试验等。细菌分离鉴定能够详细分析感染乳房炎的病原菌种类，确诊不同类型的乳房炎，但该法耗时长，成本较高。

2 免疫学检测法

根据抗原抗体特异性结合的反应特性，免疫学检测法可用于特异性检测乳汁中的病原，如检测链球菌的乳胶凝集法[4]、免疫层析法[5]。免疫学检测法具有较好的特异性和灵敏度，操作简便，反应快，但易受环境及溶质的影响。

3 基因芯片技术

基因芯片由大量的DNA探针构成，可对多种病原微生物进行同时检测，缩短了乳房炎诊断的时间。李秀萍等[6]建立的以16S rRNA为基础的基因芯片技术，6～7 h即可检测出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、绿脓杆菌、停乳链球菌和乳房链球菌6种牛乳房炎致病菌。邢会杰等[7]同样以16S rRNA为靶基因构建了检测无乳链球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和金黄色葡萄球菌的基因芯片方法，可以快速、特异、准确地对这4种菌株进行检测和鉴定。Lee等[8]开发了可以检测棒状杆菌、牛支原体、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌7种病原体的基因芯片。基因芯片技术具有方便、准确的特点，但是因其成本昂贵，且耗时相对较长，现阶段难以投入临床中使用。

4 多聚酶链式（Polymerase chain reaction，PCR）诊断法

4.1 普通PCR诊断法 自1985年PCR技术发明以来，凭借其快速、特异性强、敏感性高的特点，PCR检测法已被广泛运用于奶牛乳房炎病原微生物检测。国内外现已构建了针对乳房炎主要致病菌的多种PCR检测体系。Meiri-Bendek等[9]根据16S rRNA基因设计引物建立了无乳链球菌PCR检测体系。陈玉霞等[10]根据16-23S rRNA之间的序列设计引物，建立了快速、特异的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌PCR检测体系。李栋梁等[11]据产气荚膜梭菌、乳酸乳球菌、变形杆菌、绿脓杆菌和肠球菌的16S rRNA分别设计了5对引物，进行PCR检测，具有灵敏、高效的特点。普通PCR技术价格低廉，有着优良的特异性和灵敏度，但是检测病原单一。

4.2 多重PCR诊断法 引起奶牛乳房炎的病原菌种类多，且多呈混合感染，目前已有针对乳房炎主要致病菌构建的多重PCR诊断体系。高玉梅等[12]根据金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和停乳链球菌16S-23S rRNA区域以及白色念珠菌18S rRNA序列设计了5对特异性引物，建立了有较好特异性的五重PCR技术。许信刚等[13]根据链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌hut基因和大肠杆菌23S rRNA基因序列，设计4对引物，构建了四重PCR体系。陈亚明等[14]根据无乳链球菌sip基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌rrnB基因和蜡样芽孢杆菌hblA基因构建四重PCR体系。Shome[15]对10种牛乳房炎的致病菌建立了多重PCR检测体系。多重PCR体系可一次检测多种病原，相对于普通PCR，虽其灵敏度有所下降，但其方便、省时、廉价的特点使其应用前景广阔。

4.3 实时荧光定量PCR诊断法 实时荧光定量PCR（real-time PCR）是利用荧光信号监测整个PCR扩增过程，通过建立标准曲线来对未知模板进行定量分析。刘继超等[16]根据金黄色葡萄球菌肠毒素A基因序列，设计引物和Taqman探针，建立实时荧光定量PCR体系，其灵敏度达到1.3×102CFU/mL。Koskinen等[17]对链球菌、大肠杆菌和葡萄球菌等11个常见的病原进行荧光定量检测，均具有很好的特异性和灵敏度。Singh等[18]构建了检测李斯特菌和沙门氏菌的双重实时荧光定量PCR体系。实时荧光定量PCR与普通PCR相比，灵敏度得到了一定的提升，且能定量检测出乳房炎样品中病原体数，可在一定程度上对乳房炎病程发展进行判断。

4.4 可视化介导等温扩增法 环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技术是根据靶基因的6个区域设计4条引物，使用链置换DNA聚合酶，在恒温的条件下扩增出LAMP特征性梯状条带[19]。LAMP在乳房炎的检测上发展迅速，贺婷等[20]根据链球菌属的特异性基因（tuf）设计一套LAMP引物，在水浴锅中1 h内完成反应，其敏感性最高达到52 fg/μL。白智迪[21]根据牛支原体uvrC基因设计引物，在58℃下作用1 h，敏感度为3.4×101CFU/μL，特异性强。LAMP检测法能快速得到肉眼可见的检测结果，敏感性好，特异性强，操作简便，为乳房炎检测提供一个新的发展平台。

5 结语

奶牛乳房炎是危害奶牛业最常见的疾病之一，影响牛奶的产量和质量。目前乳房炎病原菌的检测方法中，细菌的分离鉴定是传统的确诊病原菌类型的方法，存在耗时长的缺点。基因芯片技术能同时检测出大量病原，但耗时仍比较长，且成本昂贵，难以普及。PCR方法能够准确鉴定致病菌，并且缩短了鉴定的时间，成本较低。多重PCR敏感性与普通PCR相比有所下降，但是可一次检测多种病原，缩减了检测时间和成本。实时荧光定量PCR能进行定性定量检测，学者们将其与传统的细菌分离鉴定方法做比较，证明了该法有良好的灵敏度和特异性[22]。LAMP法能够在1 h内得出肉眼可见的结果，极大的缩短了检测的时间，今后将会更广泛的运用于乳房炎的检测。随着检测技术的发展，相信未来可以研制出快速、灵敏性高、特异性强、操作便捷且廉价的早期奶牛乳房炎检测方法。

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RESEARCH PROGRESS ON DETECTION OF DAIRY COW MASTITIS PATHOGENS

DIAO Qiao-hong1,3, BIAN Guo-zhi2,3, WANG Juan1,2, LUO Ai-jian3, ZHANG Ying3, GAO Xiao-yi3,YUAN Jian-feng1,2, SUN Ling-shuang3

(1.Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry & Veterinary, Guangzhou 511400, China; 2. Guangdong Haid Group Co., Limited,Guangzhou 511400, China; 3.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Mastitis is one of the most important diseases that cause signi fi cant economic loss in dairy industry. Some mastitis pathogens have importance of public health. There are more than 150 species pathogens that can cause mastitis. Attempts to diagnose and detect these pathogens timely and accurately have been of signi fi cance in comprehensive prevention of dairy mastitis. Currently, major methods for detection of mastitis include isolation and identification of pathogens, immunological assays, gene chip and PCR. This summary provides the systemic illustration on detection methods and measures for integrated control of mastitis in dairy cows.

Mastitis; pathogen; detection method; dairy cow

S852.4

A

1674-6422（2017）04-0076-04

2016-07-14

广州市科技计划项目（201510010250）；广东省科技计划项目（2014A020208052）；广东海大畜牧兽医研究院有限公司自主项目

刁巧虹，女，硕士研究生，临床兽医学专业

袁建丰，E-mail：yuanjf@haid.com.cn；孙凌霜，E-mail：lsun42013@scau.edu.cn