兽医实验室酶联免疫吸附试验操作要点

张秀芬

（十堰市郧阳区动物疫病预防控制中心，湖北十堰 442000）

兽医实验室酶联免疫吸附试验操作要点

张秀芬

（十堰市郧阳区动物疫病预防控制中心，湖北十堰 442000）

酶联免疫吸附试验（ELISA) 用于很多试验中，在兽医实验室中，利用该方式对疫病进行检测和诊断，具有高灵敏度、操作简便的优势。本文重点分析兽医实验室酶联免疫吸附试验操作要点。

酶联免疫吸附试验 兽医 要点分析

1 前言

酶联免疫吸附试验（ELISA）具备灵敏度高、操作简单和良好的特异性。ELISA被广泛应用于疫病免疫抗体检测以及诊断中，但由于检测过程中可能会出现较多的失误，导致问题的出现，为进一步控制ELISA准确性，本文重点对兽医实验室酶联免疫吸附试验操作要点进行探究。

2 样品基本知识

主要介绍样品采集、处理以及保存的知识，ELISA测定样品很多，如血清、尿液、唾液、排泄物等。部分样品可直接开展ELISA检测，比如血清；而部分则需要经过预处理，比如粪便。兽医实验室一般根据常规方式采集样品。禽类采心脏、翅静脉采血的方式。比如猪采前臂静脉等处血；羊取颈静脉血；牛颈静脉、尾静脉血。将血清分离时，避免出现溶血。现阶段，ELISA试剂盒多数使用的辣根过氧化物酶作为标记，红细胞溶解就会释放出较多的过氧化酶活性物质，在ELISA检测中，溶血的会造成非特异性显色，导致假阳性出现，最后很难得到精确的检测结果。因此，采集来的血清样品要在一定的时间内完成检测，确保血清的有效性。血清存于冰箱时间过长，血清免疫球蛋白可能会出现聚合的情况，若5d内完成的检测血清样品，要将至放于4℃环境中的；超过7d则要将之放于-20℃环境下存放。冻结血清样品后，蛋白质有局部浓缩不匀的现象出现，就要将之轻轻来回垫颠倒让其充分混合，动作幅度不宜过大。血清样品反复冰冻对抗体有效性有影响，因此检测抗体血清样品要做几次检测；同时要确保血清的纯度，不得有浑浊物在其中，避免假阳性反应。

3 操作要点

3.1 加样

加样是试验结果的重要因素，选择移液器方面，尽量选取与加样量接近的移液器；尽量使用统一移液器，加样姿势一致。另外，取样时，移液器枪头要与取液板保持垂直，有利于液体体积平衡；与此同时，加样时，枪头与ELISA板孔保持垂直的，有助于将之加到板孔底部，过程中要仔细不要液体涂到孔壁上。最后，加不同加样，要更换枪头，避免发生交叉感染；而加样量小，尽量的应用倒退移液方法。

3.2 温育

温育是讲抗原与抗体混合，在一定条件下进行的抗原抗体反应。实验室一般在4℃、37℃以及43℃的情况下，开展ELISA反应的温育操作。温育过程中，除了确保反应温度及时间，同时还要注意反应样品在温育温度下要快速达到平衡，一次不能增加太多反应板叠块在培养箱中。并根据ELISA规定的要求，室温进行温育反应，严格控制温度，确保试验结果的精确度。试验中温育的温度与时间要严格控制，确保试验精确性，温育避免发生有蒸发的情况，并采用的塑料贴纸或者是保鲜膜将板孔覆盖，并将ELISA板放于湿盒内部。

3.3 洗涤

ELISA试验时，洗涤主要是为了将吸附在反应板上的污物，因此，洗涤效果对于ELISA试验结果是非常关键的作用。而洗涤过程中，试验操作人员要根据规定备好洗涤液，完成规定洗涤次数及，并于规定时间内完成。开展ELISA试验，可将浸泡时间加长以及增加洗涤次数，有助于减少反应本底读数[1]。

3.4 显色和比色

酶催化无色底物，并生成有色产物的这一过程即为显色。出现显色主要是受到显色反应温度和时间。定性ELISA试验中，显色于室温即可开展，根据阴性、阳性对比孔显色的情况及时对反应时间进行调整。但在ELISA试验中一定要按照的说明书进行，确保显色反应的温度和时间，保证得到有效的试验结果。酶标仪器放于通风、避免阳光照射处，仪器温度保持在15℃～30℃范围内。比色前将酶标仪预热15～30min，保证测度结果。比色前，将底物对照孔和空白孔相关信息详细登记，并将本次试验的试剂情况。每一次试验比色前使用洁净吸水纸将板底液体吸净。

4 规范操作要点措施

而在检测的过程中，质量控制极为关键，直接关系到检测结果的准确性，对质量控制体系进行建立与完善，使各项检测操作能够按照相关规定规范进行。（2）不断加大检验人员的培训力度，提升其检测技术与责任意识，使其能够严格规范各项操作，规范应用各项检测设备进行检测。（3）对试剂、质量控制产品进行合理选择，保证其稳定性与可靠性，并注重管理。（4）定期对室内质量控制情况进行分析，总结其中失控的原因，如温育时间与温度控制不准确、血清反复冻融等，及时对改进、纠正的措施进行制订，以对ELISA检测室内质量进行有效控制[2]。

5 结语

在ELISA检测中，开展监测质量控制是重要环节，是保证检测精确性的关键。ELISA检测的操作要点分析中包括加样、洗涤、显色和比色等内容，开展ELISA试验，针对以上各要点，一定更要选取品质优良的ELISA试剂盒；并定期检查移液器、温箱、酶标仪器等，试验过程中按照规定严格控制实验室环境温度、湿度；提升试验人员的操作试验的专业度。总之，要保证得到优质的ELISA检测结果，就要选择优质试剂、仪器并实施严格的操作，对保证和提升ELISA检测结果准确率具有十分重要的意义。

[1]杜敏，马耀斌.浅析实验室常规ELISA检测[J].兽医导刊，2016，5（12）：214.

[2]乔丽.浅谈兽医实验室工作几点注意事项[J].中国畜牧兽医文摘，2016，32（12）：148.