基因芯片技术及其在畜牧兽医业中的应用概述

2017-01-16李博岩王旭平柳诚刚杨汝才

中国畜牧兽医文摘 2017年9期

陆曼李博岩王旭平柳诚刚谭斌杨汝才

陆曼李博岩*王旭平柳诚刚谭斌杨汝才

1 基因芯片技术的发展历史

基因芯片（gene chip）亦称 DNA 芯片，主要是指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，用以实现对细胞、核酸、蛋白质及其他生物组分的快速、准确、大信息量检测。随着人类基因组计划（HGP）的实施，基因芯片应运而生，该技术是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术创新。

基因芯片的原型是在 20 世纪 80 年代中期出现的，它依据计算机半导体芯片制作技术中晶体管集成在芯片上这一原理，将寡核苷酸分子集成在芯片上而制成。Bains 等运用杂交的方法将短的 DNA 片段固定在支持物上，并借助杂交原理对其序列进行了测定。基因芯片真正从实验室走向工业化得益于照相平版印刷技术与探针固相原位合成技术的结合以及激光共聚焦显微技术。这些技术的引入使数以万计的高密度探针分子的合成与固定成为可能，而激光共聚焦显微扫描技术也有可能让杂交信号的准确、实时、灵敏的检测和分析成为现实。1990 年，美国 Affmetrix 公司的 Fodor 等通过实验把一种光敏材料涂布在硅芯片表面，通过光蚀刻技术原位合成了多肽链。在此基础上，Fodor 等进行了技术改进，最终率先合成了 DNA 阵列。1997 年，斯坦福大学 Brown 实验室研制出了世界上第一张全基因组芯片。此芯片是酵母全基因组芯片，具有 6166 个基因，它的研制成功开创了基因芯片技术应用的先河。

1970 年以后，随着基因组学、生物信息学、系统生物学等新兴学科的迅猛发展及人们消费观念的改变，动物育种目标由单一的常规育种向分子与常规联合育种转变，肉用性能相关基因的筛选成为研究热点。基因芯片及荧光定量 PCR 技术的出现为肉牛肉质性状的系统研究提供了强有力的手段。

2 基因芯片简介

2.1 基因芯片的原理

基因芯片是建立在杂交测序技术和基因探针上的一种高效快速的核酸序列分析工具。杂交测序是基因芯片的测序原理。此方法是将大量的基因探针高密度地、有序地排列在一块 1～2 cm2大小的载体上，随后用标记的待测样品与之杂交，通过分析检测杂交信号的分布及强度便可以获得样品中待测 DNA 的各种数据。

2.2 基因芯片的类型

基因芯片可以分为三种类型:①用聚合物基片（硝酸纤维膜或尼龙膜等）制成的芯片。这种芯片的核酸探针或 cDNA 片段被固定在聚合物基片表面上，检测时同位素标记的靶基因与其杂交，之后采用放射显影技术进行分析检测。此方法的优点是可以方便地使用目前分子生物学常用的放射显影技术及其所需检测设备，检测技术比较成熟；缺点是芯片上的探针密度不高，要使用大量的试剂和样品，不完全适合于定量检测。②用玻璃板作为探针的载体制成的芯片。这种芯片的 DNA 探针阵列是用点样法固定在玻璃板上的，检测时将荧光标记的靶基因与玻璃板上探针进行杂交，然后检测杂交分子的荧光数据，便可获得靶基因的相关资料。这种方法的优点是大大提高了探针的密度，有利于获得比较高的检测精度；缺点是批量化和标准化生产方面仍有较多困难。③用玻璃或其他硬质材料薄片作为探针的载体制成的芯片。这种基因芯片的寡核苷酸探针阵列可在载体表面上直接合成，检测时将荧光标记的靶基因与寡核苷酸探针杂交，并进行后续的荧光检测，便能获得靶基因的各种数据。此方法是把 DNA 化学合成技术与微电子光刻技术相结合，优点是大大提高了基因芯片探针的密度，可以进行规模化生产，有很大的发展空间。

2.3 基因芯片的优点

基因芯片有以下优点: ①使在同一条件和时间下需要多次处理的遗传分析能快速完成，有很强的类比性；②细胞、组织、血液等的基因表达信号的定量、定性分析可以在同一张芯片上获得，并还可以实现时间与空间上、全局检测静态到动态的差异及遗传信息的检测，有很大的信息产出率；③有较强专一性和高度的敏感性，可以精准和可靠测定 10pg /μL 的 DNA 样品；④尼龙膜制作的微阵列，可重复进行多达 20 次杂交实验，有很好的重复使用性；⑤已有的芯片面积最小的仅有 1 cm2，最大的也不超过525cm2，所以每个阵列中 DNA 样品的用量较少，反应体积和试剂用量也相应地大大减小，但反应效率却提高了百倍，有利于实现测量的自动化和微型化；⑥基因芯片技术容易与其他技术相互交叉使用。

2.4 基因芯片技术的操作流程

生物芯片技术操作流程主要包括四个步骤: ①芯片方阵的构建: 将玻璃片或硅片作表面处理，并将蛋白质分子或 DNA 片段按顺序排列在芯片上；②样品的制备: 获取生物样品中的DNA、蛋白质或 RNA 并对其做标记，可以大大提高检测的灵敏度（一般情况下，待测材料不能直接与芯片反应，只有少数的特殊样品除外）；③生物分子反应: 芯片检测的关键是芯片上的生物分子之间的反应，应当选择最合适的反应条件，使生物分子间反应条件处于最佳状况，从而使生物分子之间的错配比率大大降低；④芯片信号的检测: 将芯片置入芯片扫描仪中是常用的芯片信号检测方法，扫描后便可获得有关生物信息。

3 基因芯片在畜牧兽医业中的应用

3.1 牲畜基因表达水平的检测

对于基因的保守片段设计了多对完全与之匹配的寡核苷酸探针（PM）以及相应的中心单碱基错配的寡核苷酸探针（MM），将它们固定在芯片的相邻位置上，便可用来对标记的样品靶序列进行杂交探测。阳性情况下（正常完全匹配），PM 的杂交信号明显强于 MM 的杂交信号；而假阳性时（错配），两者的杂交信号差异不明显。所以， PM/ MM（PM 与 MM 的信号比值）可作为衡量阳性的指标，当某一基因三条以上探针呈阳性时，可定性判断闲逛基因的表达。而通过比对异常和正常样品杂交信号，则可检测不同样品中基因表达水平的变动趋势。

这方面的研究已有不少报道。朱正茂等以杜洛克猪胎儿骨骼肌 5 个不同发育时期的背最长肌作样本研究其基因表达谱，并对结果进行聚类分析，获得了骨骼肌发育的变动信息。Lin 等运用由 9182 个 cDNA探针构成的基因表达谱芯片对杜洛克和桃园猪骨骼肌表达谱进行了分析，发现杜洛克猪中与转率调控蛋白、肌原纤维蛋白、能量代谢酶相关的基因表达上调，解释了杜洛克在出生后比桃园猪具有更高的肌肉增长率的作用机制。Ushizawa 等根据牛肝脏 cDNA 序列制备了代表 2059 个牛基因的芯片，并检测了妊娠牛基因转录差异，结果发现在怀孕第 27 ～ 28 d 时大多肝脏基因被诱导表达。Yao 等用卵母细胞 cDNA 文库建立了基因芯片，为卵泡发育和早期胚胎发育机理的研究提供了有力的工具。张国梁等利用基因芯片技术构建了中国草原红牛公牛与阉牛差异基因表达谱。

3.2 兽药筛选和新兽药的开发

基因芯片技术可以用来鉴定和分离药物的有效成分，解决了目前兽药产业开发遇到的重要困难。很多兽药是直接或者间接地通过改变、修饰动物基因的表达或基因表达产物的功能而生效。所以，可通过基因芯片技术分析动物机体用药前后的不同器官、组织基因表达的差异，从众多药物成分中筛选出真正起作用的组分物质。基因芯片技术在药物筛选方面有着巨大的优势，因为该技术具有大规模、高通量、平行性地分析基因表达的能力。利用基因芯片技术作大规模的筛选研究可以缩短药物筛选所用时间，节约大量的动物实验，降低风险和费用，大大提高效率。

3.3 畜禽疾病的诊断

伴随着畜牧业的发展，动物传染病的流行变得更加复杂，畜禽疾病的诊断和防治也随之更加困难。传统的诊断方法虽然可靠，但是每次只能检测一种病原；而生物芯片能一次检测多种病原，而且具有需要样品量少、特异、灵敏、快速和费用低廉的优势。

基因芯片在该领域的应用研究的报道很多。美国科罗拉多大学与疾病控制和预防中心研发的“M 基因芯片”，采用流感病毒基因模版，可快速检测各种流感病毒，其中包括 H5N1 型高致病性禽流感病毒，可轻易将 H5N1 型禽流感病毒与普通感冒病毒相区分。陈凤梅等应用 RT － PCR 或 PCR 方法分别获得鸡禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎等 14 种家禽疾病的病原核酸特异性片段，并以这些片段为探针，采用接触式电样技术制成低密度的 DNA 阵列芯片，同时成功检测了这 14 种禽类传染病，验证了该新颖 DNA 阵列芯片的良好检测效果。

3.4 园林观赏动物的DNA测序

HGP 计划的实施促进了高效的自动化测序方法的发展，基因芯片利用固定探针与样品之间分子杂交产生的杂交谱而排列出待测样品的序列，此测序法比传统的 Sanger 双脱氧链终止法快速且前景诱人。

例如，美国 Affymetrix 公司于 1998 年生产的带有13.5 万个基因探针的芯片，使人类 DNA 的解码速度比原来提高了 25 倍。Mark chee 等用带有 13.5 万个寡核苷酸探针阵列测定了全长为16.6 kb 的人线粒体基因组，其准确率高达 99% 。Hacia 等也曾用含 4.8万个寡核苷酸的高密度微阵列分析了人与黑猩猩BRCA1 基因序列的不同，发现在该基因外显子中的部分核酸序列同源性为83.5% ～ 98.2% 之高，揭示了两者在进化上的高度一致性。

3.5 寻找牲畜新基因

研究表明，在序列信息缺乏的条件下，可采用基因芯片技术寻找新基因。Chitko －McKown 等研究了牛巨噬细胞基因用脂蛋白（LPS）处理过后表达的变化情况。他们将人的基因芯片与反转录的牛巨噬细胞基因的 cDNA 进行杂交，发现有 44个基因的表达存在差异，其中有 18 个基因是牛的巨噬细胞新基因。Dvorak 等在研究猪肠黏膜的派伊尔氏淋巴集结功能的分子机制时采用了基因芯片技术。研究表明在 3687 个表达序列标签（ESTs）中出现了2414 个特异核苷酸序列，其中至少有 371 个基因是新基因。Schena 等将热休克作用和佛波酯处理的 T细胞的 cDNA 与包含1056 个 cDNA 的芯片杂交，得到了 4 个新基因。

3.6 畜禽高产、优质、高抗性等基因的筛选及优良杂种后代选育

畜禽的基因型决定不同性状的表型，是由单一或众多基因相互协同作用的结果。畜禽高产、优质等性状可能是质量性状也可能是数量性状。通过分子生物学方法，已经找到了很多由单一基因控制的性状，但其对于鉴定由多基因控制的多态性变化与畜禽表型的关系，以及发现更多的有用基因则显得无能为力。通过采用基因芯片技术使快速发现具有重要应用价值的新基因以及研究基因表达的多态性成为可能，为传统分子生物学研究提供了新的工具和思路。通过制作全基因组芯片，可以在多样本大群体中快速识别与相关性状和功能有关的特殊功能基因，从而为物种改良、新品种选育、加快育种进程提供理论基础。在育种过程中选择优良杂种后代，最困难的一步是从大量的杂交组合群体中筛选具有目的基因的优良杂合体或者纯合体，从而选育出具有优良性状或者符合育种目的的目标个体。利用基因芯片技术，可简化传统的育种程序，通过制作带有筛选目的基因的芯片，采集分离出来的畜禽基因，不再需要通过繁杂的辛勤的育种工作和长时间的选择，就可以实现从杂种后代中筛选出优良个体，并育成新品种的过程。因此，通过基因芯片技术，可以改变传统育种工作模式，使畜禽遗传育种工作变得简单、高效、快速、精确。李艳华等采用基因芯片技术以及其他相关技术，筛选出了与猪群的鲜肉产品的感观质量及其加工性状、胴体组成、脂肪的质量性状（包括脂肪含量、嫩度、肉色、肌纤维直径、大理石纹等）等肉质性状相关的遗传效应和主基因关联十分明显的遗传标记。