法氏囊新分离活性肽种类及生物学功能研究进展①

张 聪 王 臣 陈溥言

(河南科技大学兽医肿瘤免疫学重点实验室，洛阳 471003)

法氏囊新分离活性肽种类及生物学功能研究进展①

张 聪 王 臣 陈溥言②

(河南科技大学兽医肿瘤免疫学重点实验室，洛阳 471003)

法氏囊(Bursa of fabricius,BF)是禽类特有的体液免疫的中枢淋巴器，是B淋巴细胞增殖分化的场所。其中，三肽囊素(BS)Lys-His-Gly-NH2是法氏囊组织中提取的第一个活性肽，是法氏囊的重要活性组成成分，能提高机体免疫系统功能，而且对哺乳动物也具有重要的免疫学活性及生理作用[1-4]。以往的研究主要集中在囊素的研究，近年来，随着质谱技术在蛋白质分离鉴定方面的广泛应用，法氏囊组织中陆续分离鉴定出多条生物活性肽，在免疫学活性功能及作用机制方面均有重大突破。本文旨在对新分离法氏囊活性肽的种类及免疫学功能做一个综述，并对应用前景进行展望。

1 新分离法氏囊活性肽种类

近年来，从法氏囊中分离出的多条活性肽，组成一个庞大的BP(S)P家族。BPP家族成员主要有BPP-Ⅰ、BPP-Ⅱ、BPP-Ⅲ、BPP-Ⅳ、BPP-Ⅴ、BHP、BTP；BSP家族成员有BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ；BP家族成员有BP-Ⅰ、BP-Ⅱ、BP-Ⅲ、BP-Ⅳ。

1.1BPP家族成员BPP-(I-V)，BHP，BTP Feng等[5]将鸡法氏囊中分离出的提取物超滤后，通过MADIL-TOF MS型RP-HPLC鉴定，分离出法氏囊活性肽BPP-Ⅰ、BPP-Ⅱ、BPP-Ⅲ、BPP-Ⅳ、BPP-Ⅴ、BHP、BTP。BPP-Ⅰ，分子组成为LGPGP，能增强抗肿瘤因子p53蛋白表达，诱发免疫小鼠多种免疫应答反应。是抗肿瘤和潜在的免疫调节剂。BPP-Ⅱ(MTLTG)，通过诱导免疫相关基因的表达来调节免疫功能，激活p53信号通路抑制肿瘤的发生，在体液免疫和细胞介导的免疫应答包括肿瘤抑制之间发挥重要的连接作用[6]。随后，分离出来5个新型小分子多肽，分别命名为BPP-Ⅲ(YEYAY)、BPP-Ⅳ(RMYEE)、BPP-Ⅴ(GPPAT)、BHP(AGCCNG)、BTP(RRL)。Feng等[7]分析这些肽可能来自鸡法氏囊组织的多种蛋白质，也可能是一些蛋白质的降解产物。而且在免疫接种小鼠体内产生抗体时，这些肽表现出不同的免疫调节作用，多种分子通过不同的途径发挥免疫应答作用。正因如此，维持了机体免疫系统的平衡和稳定。

1.2BSP家族成员BSP-Ⅰ和BSP-Ⅱ Feng等[8]在研究中分离了一种新的法氏囊免疫调节性多肽BSP-Ⅰ，EPASGMM，呈现出各种生物学功能。如降低了肿瘤细胞的增殖，引发肿瘤抑制基因p53的表达，并刺激抗体的生产和细胞介导的免疫反应。随后，确定了氨基酸序列为TPSGLVY的BSP-Ⅱ[9]。BSP-Ⅱ能够增加禽类pre-B 淋巴细胞DT40的活性，采用基因分析发现了不同的表达基因参与DT40细胞的表达途径中。六种主要的信号转导通路包括ErbB信号通路、MAPK信号通路、Toll-like受体信号通路、Notch信号通路、m-TOR信号通路、Wnt信号通路[10]。

1.3BP家族成员BP-(I-IV) Liu等[11]通过RP-HPLC和MADIL-TOF方法分离并鉴别(BP)-Ⅰ(ALPVVVⅡ)、BP-Ⅱ(DRATHGGE)、BP-Ⅲ(GANEVEEER)、BP-Ⅳ(KNEVEEEAKTP)这几种肽能促进CFU前体B细胞的分化，降低PU.1的表达水平。其中， BP-Ⅳ还通过介导体液和细胞免疫增强接种灭活禽流感病毒(AIV;H9N2亚型)的鸡和小鼠体内抗原特异性免疫应答，其中包括增强特定AIV抗体和细胞因子产生[12]。

1.4法氏囊活性肽BP5、BP8和BP11 Li等[13]通过反向高效液相色谱法RP-HPLC分离纯化出五肽BP5(Cys-Lys-Arg-Val-Tyr)，626.27 D。发现BP5显著增强灭活AIV疫苗免疫小鼠体内免疫应答反应， BP5在免疫小鼠体内通过直接活化B细胞和间接活化T细胞促进小鼠脾淋巴细胞的分化，增强特异性抗体免疫应答水平。Liu等[14]通过RP-HPLC和MALDI-TOF-MS法分离，鉴定出八肽BP8，分子序列为AGHTKKAP。发现BP8能够促进前体B细胞的形成，基因芯片技术证实BP8作为B细胞发育和新陈代谢作用间的连接物对免疫系统的发育具有重要作用[15]。随后，Liu等[16]采用同样的方法分离鉴定出BP11，氨基酸序列为DVAGKLPDNRT。证实BP11与禽类免疫系统密切相关，能够促进CFU前体B细胞的形成和分化，刺激抗体的产生，提高Th1和Th2因子分泌水平。

2 新分离法氏囊活性肽免疫生物学功能

2.1法氏囊活性肽促进B细胞发育 禽类B淋巴细胞在法氏囊中发育成熟。B淋巴系祖细胞分化为前B细胞，进一步发育活化为成熟B细胞，接受抗原刺激产生抗体。BP家族BP-Ⅰ、BP-Ⅱ、BP-Ⅲ、BP-Ⅳ、BP5、BP8、BP11这几种肽能促进CFU前体B细胞的分化[11,13,14,16]。Feng等[6,10]发现BSP-Ⅱ、BPP-Ⅱ能够促进B细胞发育，BSP-Ⅱ增加禽类pre-B 淋巴细胞DT40的活性。Feng等[17]用BPP-Ⅱ免疫禽类B淋巴细胞DT40，采用基因微阵列从基因水平证实BPP-Ⅱ同源重组是B细胞发育过程中参与抗体基因转变和分化的主要作用机制。法氏囊活性肽促进B细胞发育的作用机制有待进一步研究。

2.2法氏囊活性肽的免疫佐剂潜能 法氏囊活性肽大多具有免疫调节功能，联合疫苗能提高特异性抗体和细胞因子分泌水平，促进淋巴细胞增殖，同时增强机体体液和细胞免疫应答。Li等[13]，Feng等[8]分别用BP5、BSP-Ⅰ联合灭活AIV疫苗免疫小鼠，发现两种多肽能显著增强小鼠体内特异性IgG抗体水平、Th2型(IFN-γ)和 Th1(IL-4)型细胞因子的分泌水平，促进外周血淋巴细胞增殖，增加CD3+T细胞种群和其亚群的CD4+(CD3+CD4+)T细胞和CD8+(CD3+CD8+)T细胞数量。同时，Li等[18]用BP5联合灭活禽流感病毒AIV免疫鸡，发现BP5通过抑制鸡肺脏病毒的复制对抗同源禽流感病毒攻击。现已证实，法氏囊活性肽具有良好的免疫佐剂潜能，应用于疫苗的研发具有广阔前景。

2.3法氏囊活性肽的抗氧化功能 已经发现，一些硫醇化合物，如谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)保护活细胞免受氧化应激。BP5作为一种含有硫醇的新分离活性肽，是否可以保护活细胞免受氧化应激？为了验证这一猜想以及这一过程背后可能机制，Li等[19]用BP5处理由脂多糖(LPS)活化的小鼠腹腔巨噬细胞。发现BP5可以保护LPS激活小鼠腹腔巨噬细胞对抗氧化应激。提示BP5除了作为一种新型免疫活性调节肽显著增强机体特异性免疫应答，同时，BP5也表现出抗氧化应激方面的特性。Liu等[20]在他的研究中报道了BP5对B细胞发育的作用，证实BP5通过增加CFU-preB显著促进B细胞发育。同时，BP5诱导葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)活性，一个基本的抗氧化剂辅助因子，减少G6PD缺陷细胞调节氧化还原平衡。这些数据表明，BP5通过促进G6PD的表达影响氧化还原平衡朝向，这反过来又调节谷胱甘肽氧化还原循环和其他进程。

2.4法氏囊活性肽对树突状细胞的作用 众所周知，树突状细胞(DCs)在炎性疾病的免疫调节中发挥着重要作用，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，DCs已经被认为是免疫调节剂发展的主要目标。然而，氧化应激可能干扰DCs中的炎症调节。BP5对DCs免疫功能影响尚未证实。Yang等[21]的研究中发现BP5显著抑制树突状细胞中LPS诱导的促炎因子(TFN-α、IL-1β、IL-6和IL-12p70)和抗炎因子(IL-10)的产生。进一步研究发现，BP5对DCs中LPS诱导的氧化应激反应显示出潜在的保护作用。在LPS刺激肠上皮细胞(ECS)/DCS共培养体系中，BP5还抑制黏膜下DCs的成熟。BP5显著上调LPS诱导的DCs中血红素加氧酶-1(HO-1)水平，在氧化应激的抑制中起到了重要作用[22]。这些结果表明，BP5可能抑制DCs的免疫功能来治疗慢性炎症和自身免疫病。

2.5法氏囊活性肽的肿瘤抑制功能 法氏囊活性肽具有多种生物学功能，为了研究其是否具有肿瘤免疫方面的功能，Feng等[23]采用基因芯片分析BP5处理的杂交瘤细胞基因组表达图谱，发现BP5通过26条生物途径参与免疫功能调节，其中p53信号通路在抗肿瘤方面发挥了重要作用，并由p53荧光素酶报告分析和p53的表达进一步证实。众所周知，p53是机体重要的抑癌基因，调控细胞周期，诱导细胞凋亡。主要在转录水平通过调控一些编码细胞生长和凋亡过程中的关键因子抑制肿瘤的发生，p53可启动p21的合成，而p21是细胞周期依赖性激酶的抑制蛋白，能抑制细胞周期依赖性酶的活性，进而引起细胞周期阻滞[24-26]。王臣等[27]筛选出三条BP5特异性结合肽分别为P2-12、P6-12、P7-12，显示3种BP5特异性结合肽在试验浓度下均能下调BP5促p53基因转录的活性。郭香玲等[28]筛选出3条BPP-Ⅱ特异性结合肽:P3-12、P5-12、P6-12，发现BPP-Ⅱ 能特异性抑制小鼠B淋巴肿瘤细胞WEHI-231，人鼻咽癌细胞CNE，大鼠肝瘤细胞RH-35等肿瘤细胞的增殖，机制可能与激活p53信号通路有关。为进一步研究BP5抗肿瘤作用的分子作用机制，王臣等[29]筛选到BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白VEGFA、CCNE1、TRAPPC2。基因芯片技术分析BP5刺激后鸡DT40细胞基因表达谱，证实BP5通过p53信号通路发挥抗肿瘤生物学功能。Zhou等[30]证实BSP-Ⅱ通过p53信号通路途径抑制瘤细胞的分化。Feng等[8]发现BSP-Ⅰ能降低肿瘤细胞的增殖，引发肿瘤抑制基因p53的表达。法氏囊活性肽BP5、BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ均表现出潜在的肿瘤抑制功能，而具体的作用机制有待进一步研究。

3 小结

法氏囊作为禽类特有的中枢免疫器官，诱导B淋巴细胞增殖分化，在免疫系统中发挥重要作用。从法氏囊中新分离的数十种生物活性肽，表现出不同的生物学功能，奠定了法氏囊在免疫系统中的地位。以往，对法氏囊的认识主要表现在体液免疫调节方面，目前，法氏囊活性肽表现出来抗氧化，肿瘤抑制等功能，打破了以往认为法氏囊仅在免疫调节方面起作用的局限，同时拓宽了法氏囊这一免疫器官的功能。对法氏囊活性肽的研究也为免疫学研究提供新思路，为免疫学甚至生命科学的发展起到推动作用。同时，我们应该清楚地认识到目前存在的一些问题，首先，随着科学技术的进步和研究的进一步深入，法氏囊中其他种类的活性肽有待发现。第二，法氏囊活性肽潜在的生物学功能有待进一步挖掘。第三，目前国内外对法氏囊活性肽类生物学功能的机理报道较少，因此具体详尽的作用机理有待进一步探明。

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10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.029

S852.4

A

1000-484X(2017)12-1888-04

①本文为国家自然科学青年基金项目(No.31101792)和河南省高校青年骨干教师项目(No.2012GGJS-07)。

②南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室，南京 210095。

张 聪(1994年-)，女，在读硕士，主要从事动物分子病原学与免疫学研究。

及指导教师：王 臣(1979年-)，男，博士，教授，主要从事动物分子病原学与免疫学研究，E-mail:wangchen2001@126.com。

[收稿2017-02-19 修回2017-05-17]

(编辑 张晓舟)