禽白血病及其诊治技术研究进展

张红云，陈秋英

（1. 玉林市动物疫病防控控制中心，广西玉林 537000；2. 广西丽原生物股份有限公司，广西南宁 530105）

禽白血病及其诊治技术研究进展

张红云1，陈秋英2

（1. 玉林市动物疫病防控控制中心，广西玉林 537000；2. 广西丽原生物股份有限公司，广西南宁 530105）

为了解我国禽白血病的研究现状，本文概述了禽白血病及禽白血病病毒基本特征，对比分析了国内外建立的多种禽白血病病毒检测方法，包括病原学方法、血清学方法和分子生物学方法，提出了加强监督和疫病净化、预防疫苗污染等防控建议，以期为禽白血病防控提供参考。

禽白血病；J亚群；诊治技术；预防控制

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的一种危害鸡群的传染性肿瘤病。自1868年禽白血病被首次报道以来，该病因造成较大的经济损失而被广泛关注[1]。该病最早在我国发现于一些肉鸡病例中，后来逐渐出现在蛋鸡群体中，鸡感染后会出现肿瘤性死亡、生长性能下降和免疫抑制等症状，给我国养鸡业造成了严重损失[2-3]。

ALV是一种反转录病毒，既可以通过种蛋垂直传播，也可以水平感染。根据病毒与宿主细胞特异性相关的囊膜蛋白的抗原性，可将ALV分成A—J 10个亚群，自然感染鸡群的包括A、B、C、D、E和J 6个亚群[4]。2012年，王鑫等[4]从我国地方品种芦花鸡中分离到3株ALV，经鉴定这3株病毒与已知感染鸡的6个亚群均有一定的差异性，属于一个新的亚群，被定名为K亚群。其中，E亚群是非致病性的或者致病性很弱，J亚群的致病性和传染性最强[5]。J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是20世纪80年代末期在英国从肉用型鸡群中分离到的一种致病性ALV新亚群。1999年，国内杜岩等[6]首次从市场肉鸡中分离检出J亚群ALV，随后该病毒在多个省份都有检出[2]。ALV-J可引起肉鸡骨髓细胞瘤和血管瘤、体重下降、生长抑制和严重的免疫抑制。蛋鸡可感染，但自然发病率很低。2005年徐镔蕊等[7]用ALV-J gp85单克隆抗体在分子水平上证实了我国蛋鸡中存在J亚群ALV，而一些地方品系鸡也被证实有ALV-J感染的存在[8]。

有学者一直关注该病在我国的发生与流行情况，但目前仍无有效的商品化疫苗，也无特效治疗药物。因此，通过各种方法对鸡群进行ALV检测，淘汰带毒种鸡，逐渐净化种鸡群，仍然是当前预防该病的主要方法。面对这种由病毒感染引起的传染性肿瘤，选择一种有效的诊断方法是预防该病的重要环节。多年来，国内外相继建立了多种ALV检测方法。本文对一些常见方法进行分析比较，以期有助于鸡群中ALV净化工作的顺利进行。

1 禽白血病的诊断技术

1.1 病原的分离与鉴定

通过细胞培养和鸡胚分离培养进行病毒的分离鉴定，被认为是目前最可靠的方法。但该方法耗时较长、操作过程复杂，不适用于禽白血病的快速诊断和临床应用。而将该方法结合酶联免疫吸附试验（ELISA）或间接免疫荧光试验（IFA），可以对鸡群ALV进行批量检测，适用于该病的流行病学调查和鸡场净化。

1.2 血清学检测方法

1.2.1 琼脂扩散试验。20世纪80年代，张晶[9]等研究出从羽髓中检测ALV群特异抗原的琼脂扩散试验，该方法操作简便，适用于现场大面积应用，曾在我国的种鸡ALV净化工作中发挥重要作用。2003年，我国出入境检验检疫行业将利用琼脂扩散试验检测鸡白血病的方法形成了行业标准（SN/ T 1172—2003）。但是由于琼脂扩散试验的敏感性较差，且会出现一定的假阳性[10]，现在已较少使用。

1.2.2 病毒中和试验。病毒中和试验具有较强的特异性。一个亚群中的ALV只能被同亚群中的ALV对应的抗体所中和，这也是ALV亚群的分类基础之一[11]。因此，可以用J亚群ALV检测感染鸡血清中的ALV-J特异性抗体。但ALV-J存在抗原多样性，而只有抗体与病毒粒子的表面抗原相对应，才能获得最准确的实验结果。病毒中和试验能够大批量检测样品，是一种检测ALV的经典方法，但因试验操作烦琐，耗时费料，不适用于临床诊断。

1.2.3 ELISA。Smith等[12]提纯了P27蛋白，并建立了检测ALV的双抗体夹心ELISA。该方法简便、快捷、敏感、高效，适用于大面积检测。秦爱建等[13]利用ALV-J囊膜蛋白特异性单克隆抗体建立的夹心ELISA法，特异性高，适用于大规模检测。叶建强等[14]利用抗ALV-J囊膜蛋白特异性单克隆抗体JE9，建立了检测ALV-Jenv抗原抗体免疫复合物的ELISA方法。2013年，廖亚琳等[15]利用ALV-J gp85单因子血清纯化后的抗体建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法，其具有良好的特异性、重复性和稳定性，对ALV-J抗原的最小检出量为0.165 µg/mL。

1.2.4 IFA。秦爱建等[13]研制出的抗ALV-J nev的单克隆抗体，可鉴定所有的ALV-J变异株，其特异性高，并能检出组织或培养物中的ALV-J。徐镔蕊等[16]用F1144单抗和FITC标记的羊抗鼠二抗联合成功鉴定了从蛋鸡中分理处的ALV-J。单克隆抗体的间接荧光抗体检测方法，敏感性与特异性较强，但操作复杂，耗时较长，不适于在临床中推广应用，目前多用于实验室辅助检测。

1.2.5 小结。血清学检测方法是依据抗原与抗体之间发生特异性结合的原理来检测抗体和抗原的检测方法。血清学检测时，主要针对两种ALV抗原蛋白，其中gp85是囊膜糖蛋白，可以区别不同亚群，对A、B和J亚群ALV，可以用针对该蛋白的检测试剂盒进行检测。而p27是衣壳蛋白，属于群特异性抗原，不能区分亚群，因此在检测过程中可能会受内源性ALV-E的干扰，出现假阳性，需针对不同的ELISA检测方法进行进一步验证试验。总的来说，上述ALV的血清学检测方法中，ELISA方法最为常用。相对于其他血清学检测方法，ELISA方法操作简便，特异性强，重复性好，适用于大批量样品的检测，在临床上应用较广泛，市面上也有专门的检测试剂盒在销售，这也是国内外一些大型养禽场对禽群中ALV的进行定期检测和种群净化时常用的方法。

1.3 分子生物学检测方法

1.3.1 聚合酶链反应（PCR）和反转录聚合酶链反应（RT-PCR）。PCR方法因检测组织或细胞培养物中ALV前病毒DNA高灵敏性而被广泛应用。Smith等[17]分别从pol基因和gp85基因片段中选取一段作为上游和下游引物序列，避免了与内源性EAV序列发生非特异性反应。Smith[18]等、秦爱建[13]等分别基于env基因序列建立了PCR检测方法，但由于ALV-J不同毒株中env基因的变异较大，需经常验证是否能检测到所有变异病毒。Kim等[19]建立了定量竞争RT-PCR法（Qc-RT-PCR），可以对ALV-J感染进行检测并定量。2012年Sathish等[20]基于ALV的p27基因建立了PCR方法。该方法同时与马立克病毒和网状内皮组织增生症的PCR方法组成多重PCR。他们在印度南部地区的一些蛋禽场收集有这3种疾病症状的样品，先用特异性抗体进行免疫组化试验确定样品的病理变化，再进行病毒细胞分离培养和免疫荧光试验验证样品中这3种病原的存在，然后设计特异的引物同时进行多重PCR，试验表明检测的阳性结果是一致的。这种方法能够这3种禽肿瘤病进行快速鉴别诊断，适用于临床上对禽肿瘤病多重感染的鉴别诊断。

1.3.2 实时定量PCR（real-time PCR）。实时荧光定量PCR能够更准确和特异地检测病毒。Kim等[21]采用实时荧光定量RT-PCR方法对ALV-J RNA进行检测并量化，并将结果与其他检测方法的结果进行比较，发现该方法特异性强、易于操作、重复性好，但敏感性低。2013年Qin等[22]建立了TaqMan探针实时RT-PCR检测ALV。该方法对ALV-J特异性高。将ALV-J的DF-1细胞培养物，用该方法与TCID50和p27抗原蛋白特异性检测，得出的病毒增长曲线是一致的。将该方法与病毒分离培养和普通PCR方法，对同一批组织样品进行检测，结果显示该方法的阳性检出率均高于另外两种方法。这种TaqMan探针实时RT-PCR特异性强、敏感性高，在临床检测和实验室中都适用。2015年Dai等[23]建立了可以分别检测ALV-J和ALV-A/ B的SYBR Green I real-time PCR方法。经验证，该方法对ALV-J和ALV-A/B的敏感度比普通PCR高了近百倍，对组织样品的阳性检出率也高于普通PCR和病毒分离培养的方法。它们还利用这种方法对感染鸡的各个组织进行检测，找出ALV-J在体内的分布情况。

1.3.3 原位PCR。徐镔蕊等[7]采用原位PCR和原位杂交技术扩增ALV-J DNA，从分子水平上证实了蛋鸡中存在ALV-J感染。

1.3.4 环介导等温扩增技术（LAMP）。Zhang等[24]以普通水浴锅和3对特异性引物建立了一种ALV-J的检测技术。该方法灵敏度高、特异性强、简便快捷、成本低，适用于临床快速检测。

1.3.5 小结。PCR检测方法在敏感性和精确性上均高于ELISA检测方法，在检测ALV病毒前基因组时，具有较高的特异性。但该方法不能保证能够检出发生变异的新病毒，因此必要时需要通过其他方法来验证病毒的变异情况，确保结果的准确性。此外，PCR检测方法对试剂、仪器等有特定要求，操作过程复杂，因此该方法适用于实验室检测，不适于在临床应用中推广。每种检测方法均有优劣之分，单纯一种方法检测容易出现漏检、假阳性等问题。因此，在进行ALV诊断时，应该根据实际需要选择合适的方法结合起来进行检测，从而提高检测准确率。

2 禽白血病的预防和控制

目前还没有有效预防ALV的疫苗，通过加强ALV检测进行种群净化仍是主要的防治措施。早期我国有研究人员试图通过对种鸡场进行净化，而达到控制我国禽白血病甚至是消除该病的目的，但是由于各种因素干扰，最终没有达到预期效果。随后，不加节制地从国外引种，随意扩大引种的使用代次，没有定期的检疫制度，使ALV横向传播，导致ALV扩散。

ALV的防控需要各个环节结合起来，采取综合防治措施。一是政府主管部门应该制定相关的监控、监督和检测标准，加强国外引种检测，加大内部检疫力度，使整个行业逐渐趋于标准化、规范化。二是对种鸡群进行净化。国外已经有一些大型养禽企业成功净化ALV的案例，我们可以借鉴他们的经验，结合我们自身的情况，制定一系列严格的净化措施，并切实执行，就有可能实现基本净化ALV。三是要预防弱毒疫苗的污染[25]。弱毒疫苗中外源性ALV的污染很可能是我国蛋鸡和地方品系鸡群感染ALV的原因之一。因此，需要加强弱毒疫苗中ALV的检测和监控。四是要提高科学养殖管理水平，防止因其他免疫抑制病毒的感染导致禽白血病情况恶化。

3 展望

虽然我国当前禽白血病防控体系仍不完善，想无法彻底净化该病，但是一直以来政府都在不断地努力，同时还有很多学者关注该病的发展，并致力于研究预防、检测、控制该病的方法。多年来，陆续出现了一些控制ALV的疫苗，对ALV的控制起到积极的作用。2015年Liu等[26]结合ALV和马立克病毒发明了两种可以控制这两种禽肿瘤病的疫苗，将ALV-J的env或者gag+env基因插入马立克病毒基因中组成重组病毒，制成了疫苗，均可以有效抑制ALV-J造成的病毒血症。相信随着科学技术的发展，ALV的彻底净化指日可待。

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（责任编辑：孙荣钊）

Research Advances of the Diagnostic and Control Technology for Avian Leukosis

Zhang Hongyun1，Chen Qiuying2
（1. Yulin Animal Disease Prevention and Control Center，Yulin，Guangxi 537000；2. Guangxi Liyuan Biological Co.，Ltd，Nanning，Guangxi 530105）

s：To understand the research status of avian leukosis virus in China，the basic characteristics of avian leukosis and its virus were introduced in this paper. A comparative analysis of detection methods for avian leukosis virus has been done，which include etiological method，serological method and molecular biological method. Some suggestions of prevention and control were brought forward on strengthening supervision，disease sequestration and prevention of vaccine contamination，with an aim to provide reference for prevention and control of avian leukosis.

avian leukosis；subgroup J；diagnosis and treatment technology；prevention and control

S855.3

：A

：1005-944X（2017）06-0078-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.023

禽白血病的控制与净化技术研究与应用（玉市科攻1421029）