ELISA检测方法在禽白血病净化中的应用

王广龙，王皓然，王勇，王钊哲，戴健涛，王晓枫，徐家付，姜梦，白文顺，杨亮宇，汪善荣

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201**云南农村干部学院，云南昆明650201；2.云南农大科技生物公司剑川分公司，云南剑川671300；3.曲靖市宣威龙潭镇农业综合服务中心，云南曲靖655417）

ELISA检测方法在禽白血病净化中的应用

王广龙1，王皓然2，王勇3，王钊哲1，戴健涛1，王晓枫1，徐家付1，姜梦1，白文顺1，杨亮宇1，汪善荣**

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201**云南农村干部学院，云南昆明650201；2.云南农大科技生物公司剑川分公司，云南剑川671300；3.曲靖市宣威龙潭镇农业综合服务中心，云南曲靖655417）

禽白血病（Avian Leukosis，AL）是由反转录病毒科α肿瘤病毒属禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒(ALV/RSV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称，感染率高，发病率低，是危害养鸡业的主要疾病之一。禽白血病对种鸡群的危害巨大，且目前尚无商品化疫苗，只能依靠对种鸡群的净化进行防控。至今人类还不能有效的预防和治疗本病，控制禽白血病的主要方法是通过病原检测，淘汰阳性鸡，净化种群。国内外相继建立了多种检测禽白血病的方法，其中ELISA法能高效的检测到蛋清中的ALV抗原，具有敏感、简便、快捷、适用于大面积检测的特点，在种群净化中得到了广泛的应用，但ELISA诊断试剂盒在我国还未实现商品化。在未来禽白血病的净化将通过ELISA检测方法来实现。

禽白血病；病原学；检测方法；净化；研究进展

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的一种免疫抑制性肿瘤病。ALV的自然宿主主要是鸡，其发病率和死亡率都较低，但是鸡群感染ALV后会造成生产性能下降，给养禽业来带来巨大的经济损失；目前，防控AL的方法是对鸡群进行净化。有关本病危害的研究报道可追溯到十九世纪末期，尽管养鸡者已意识到禽白血病的危害，但由于这种病流行所造成的直接经济损失相对较小，所以常被人们忽视。直到1997和1998年，J亚群禽白血病在世界范围内大爆发，除澳大利亚和新西兰外，世界各国都不同程度地遭受了J型白血病的袭击，给养禽业造成了巨大的经济损失[1]。目前还没有用于预防和治疗AL的有效疫苗和药物，国外的做法是对育种核心鸡群进行ALV的检测、蹄选并淘汰阳性鸡只，以达到净化ALV的目的。在ALV-J发现之前，国外的净化方法是成功的。我国近几年对AL的防控也借鉴了国外的方法，一些品种的净化也取得了明显的效果[2]。在进行净化的同时，行业内的研宄人员也在进行相关的研究，如针对本地鸡群的净化方法的优化，ALV检测试剂盒和疫的研发发，ALV的分离鉴定及其序列测定等，通过这些相关研宄取得的结果,更好的指导净化工作。目前，国际上检测禽白血病病毒抗原最为理想的检测方法是ELISA法[3]，它具有敏感高、简便快捷、适用于大规模检测的特点。1979年以来,禽白血病的ELISA诊断试剂盒在国外已实现商品化，但至今ELISA诊断试剂盒在我国还未实现商品化。这就给我国大、中型鸡场净化白血病带来了极大困难，尤其近年来，我国陆续培养建立了数家SPF鸡场，今后还会不断增加，对SPF鸡群AL/SV-gs抗原检查目前主要依靠进口试剂盒，不仅价格昂贵而且不方便。因此，研制较先进的国产试剂盒是我们当前急需要解决的问题。

1 ELISA检测方法

1979年，Smith等[12]用CuHCl裂解法提纯了p27蛋白，并用纯化的p27免疫家兔，获得兔抗p27高免血清(R12)，并建立了检测鸡白血病病毒抗原的双抗体夹心ELISA，具有敏感、高效、简便、快捷及适用于大面积检测的优点，缺点是同时检测到内源性ALV病毒，常使检测结果出现假阳性。但研究表明蛋清中由于内源性ALV的ELISA反应假阳性结果很少，不足以影响禽白血病的检测，因此可作为理想的检测材料。1983年，L.N. Payne等应用ELISA方法对鸡群进行检测，随后（1985）美国研制成ELISA试剂盒并于市场出售。国内张晶等（1991）建立了检测ALV抗原的Dot-ELISA和双抗体夹心ELISA法，这两种方法特异性强、重复性好。秦爱建等(1999)用单克隆抗体建立的夹心ELISA也具有很高的特异性，这种方法适用于大批量样品的检测。陈晨等(2005)利用原核表达的禽白血病病毒(ALV)p27蛋白作为抗原制备的单抗作为包被抗体，以制得的兔抗p27作为酶标抗体，建立了检测ALV抗原的双抗体夹心ELISA方法，该方法对禽白血病p27抗原的最小检出量为5ng/mL。叶建强等利用抗J亚群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜蛋白特异性单克隆抗体JE9，建立了检测ALV-J env抗原抗体免疫复合物的ELISA方法，具有快速、简便及适合大规模检测等特点。ELISA操作简便，特异性强，重复性好，耗时较短，可作为一种有效的普检方法，定期对种禽群进行ALV检测和净化。ELISA的抗原检测较抗体检测在实际中应用广。ELISA法一般不用于本病的确诊，临床上有一定假阳性率出现，但是对监测鸡群的感染程度，建立无白血病的鸡群则是必不可少的手段。ELISA还可用于检测外源性ALV感染后诱导机体产生的特异性抗体。

2 禽白血病净化方案

根据以上的检测方法，我们对核心育种鸡群禽白血病净化的方案主要有三种。

第一种方案是美国乔治亚大学禽病诊断和研究中心正在使用的方案，也是国际上通用的金标准；该方案以病毒分离技术为主要手段，具体程序是,在68日龄和168日龄时采集，核心鸡群的血浆，接种到DF-1细胞上，维持培养9天后检测细胞培养液中的ALVp27抗原，阳性淘汰，阴性留种，并釆集留种核心鸡群的下一代1日龄雏鸡的胎粪,检测其中的p27抗原,阳性淘汰。该方案的优点是排除了内源性ALV干扰而产生的假阳性样品,并且重复多次，大大降低了漏检的机率,因此准确性很高;缺点是检测时间长,成本高,过程繁琐,不易操作。

第二种方案以ELISA检测技术为主要手段，具体程序是，在18～43周龄之间，多次(至少两次)采集核心鸡群公、母的泄殖腔棉拭子或蛋清，用ELISA的方法检测其中的p27抗原，并检测它们下一代最初艘化的两只雏鸡的胎粪中的p27抗原，阳性淘汰。该方案适用于整个后备育种核心鸡群p27阳性率低于20%或是育种专家可接受的淘汰范围内的情况。优点是方法简单，成本低，容易操作，净化速度较快；缺点是无法排除内源性病毒的干扰，增加了淘汰率，在阳性率高的情况下，增加了生产成本,不利于的选种。

第三种方案以ELISA检测技术和病毒分离技术相结合为主要手段,具体程序是，在禽白血病流行病学调查的基础上，选定一个比较适合的年龄，采集育种核心鸡群的泄殖腔棉拭子或蛋清，进行ALVp27抗原检测,然后将阳性与阴性鸡分开词养，采集阳性鸡的血清或蛋清接种DF-1细胞,维持培养9天后检测细胞培养液中的p27抗原，阳性淘汰，阴性留种。该方案的优点是将EL1SA检测技术和病毒分离技术相结合,互相弥补了采用单一检测技术的一些不足,在检测时间上得到缓冲，又排除了内源性病毒的干扰，仅淘汰外源性ALV阳性的鸡只；缺点是增加了一道鉴别内外源性ALV的检测技术，操作难度和检测成本较第二种方案都有所提高。该方案比较适用于采用ELISA检测技术时,后备育种鸡群p27阳性率高于20%的情况。

3 小结

禽白血病的净化是一个长期的过程，需要经过几个世代的净化才能彻底根除这个病，在饲养管理和预防条件上改进，我国的地方品种鸡的白血病将彻底根除。

[1]朱其态.J型禽白血病[J].中国兽医杂志,2000,26(6)∶56.

[2]吴天威，林广津，张胜斌，等.广西麻(花)鸡禽白血病净化研宄初报[J].广西畜牧兽医.2011(01)∶6-9.

[3]Payne LN,Howes K.Eradication ofexogenous avain leucosis virus fromcommercial layer breeder lines[J].Vet Rec,1991,128(1)∶8-11

[4]李中明.某蛋种鸡群ALV流行病学及生物学特性的初步研究[D].山东农业大学,2010.

[5]Payne LN.Retrovirus-induced disease in poultry[J]. Poult Sci.1998,77(8)∶1204-1212.

[6]Boyce-JacinoMT,O'Donoghue K,Faras AJ.Multiple complexfamilies ofendogenous retroviruses are highly conserved in the genus Gallus[J].J Virol.1992,66(8)∶4919-4929.

[7]刘兴友.家禽免疫抑制病[M].北京市∶中国农业出版社,2011∶368.

[8]李德龙.野生鸟类及山鸡禽白血病流彳/病学调查[D].山东农业大学,2013

[9]Skehel J J,WileyDC.Receptor bindingand membrap fusion in virus entry∶the influenza hemagglutinin[J]. Annu RevBiochem.2000,69∶531-569

[10]Spencer J L,Gika F,Gavora J S,et al.Distribution of lymphoid leucosis virus and p27 group-specific antigen in tissue fromlayinghens[J].Avian Dis,1984,28(2)∶358-373.

S854.4

B

1003-8655（2017）01-0067-02

王广龙（1991—），男，汉族，海南海口人，硕士研究生，主要从事兽医临床诊断研究，E-mail：937395968@qq.com

**通讯作者：汪善荣（1967—），男，安徽寿县人，硕士，副编审，主要从事农业资源研究。