动物源性中药材甄别技术研究进展

吴绍亮 刘晗 邓俊花* 范燕茹 陆小蒙

（1.山东省临沭县人民医院山东临沭276700；2.中国检验检疫科学研究院；3.天津科技大学）

动物源性中药材甄别技术研究进展

吴绍亮1刘晗2邓俊花2*范燕茹2陆小蒙3

（1.山东省临沭县人民医院山东临沭276700；2.中国检验检疫科学研究院；3.天津科技大学）

综述了近年来研究人员在动物源性中药材物理性状、指纹图谱鉴定、色谱、光谱分析以及DNA条形码、PCR扩增等技术方面的研究进展，从而为动物源性中药材质量鉴别提供科学依据，保障食品安全。

动物源性中药材；质量；成分；鉴别

1 前言

随着中药材产业的发展，穿山甲、鹿茸、熊胆、阿胶、牛黄等动物源性珍稀名贵药材越来越受到人们的青睐。与此同时，由于利益驱使，假冒伪劣等问题日益严重，亟需真伪鉴别技术；此外，有效成分含量也影响着动物源性中药材的质量和药效[1]。因此，为了满足上述珍贵动物源性中药材产品真伪及品质检验要求，国内外科研人员展开了一系列的真伪鉴别和质量评价技术研究，本文对有关主要进展进行如下综述。

2 动物源性中药材甄别技术

2.1 物理性状鉴定

物理性状鉴定属于传统鉴别方法，主要包括感官性状鉴定和显微观察等方法。对于有丰富鉴别经验的鉴定工作者，特别是在野外、缺乏仪器的实验室、贫困地区等，物理性状鉴定有着许多现代技术无法比拟的优势，是快速鉴别药材的主要手段。

2.1.1 感官性状鉴定

对中药材包括气味、色泽、质地以及断面的感观特征等外观形态进行主观鉴别。

陈瑞生等（2013）[2]、刘灿黄等（2014）[3]对穿山甲鳞片研究发现，真品鳞片纹理不完整，常具划痕和摩擦后的土迹，而伪品的纹理则较为干净、完整，无摩擦后的痕迹和土迹。王慧春等（2005）[4]从性状、色泽、气味、口感等方面对天然牛黄和伪牛黄、骆驼黄、熊胆黄进行了鉴别，发现天然牛黄体轻、质酥脆、气清香、味苦而后微甜、有清凉感，断面可见细密的同心层纹；而伪品牛黄体较重、无清香气、味苦或甜，断面粗糙无层纹或有不自然层纹。王淑娟等（2010）[5]亦发现，穿山甲的新鲜断面在365 nm波长紫外光下显黄绿色荧光，混淆品则无荧光。

药材经过捣碎或磨成细粉后，原有的外表形态特征大部分消失，用肉眼较难鉴别其真伪，因此性状鉴定多用于初加工产品及现场快速查验，对仪器设备没有特殊要求，主要依赖于操作人员的经验，主观性强，具有相当的局限性。

2.1.2 显微鉴别

借助显微镜观察药材的内部组织构造、细胞形态，从而对其质地和成分组成进行大致判定。

刘灿黄等（2014）[3]对穿山甲、树穿山甲的生甲片和炮制品、塑料伪制品的显微特征研究发现，树穿山甲和中华穿山甲横切面显微特征差异明显，塑料伪制品无细胞结构。

陈代贤等（2000）[6]对商品中出现的11种鹿茸进行了主要显微组织比较观察，发现麋鹿茸的血管壁有显著的增厚，豚鹿茸的动脉血管最明显，瓜哇鹿茸的茸毛最长，而水鹿茸的皮脂腺最大，狗茸有梭形细胞层，相关显微特征为鉴别不同种类鹿茸提供了参考依据。

傅颖等（2012）[7]运用显微鉴别技术，对麝香的真伪进行鉴别，表明野生国产麝香、进口俄罗斯麝香、家养国产麝香都与麝香对照药材具有相似的显微特征，即有大量无定型颗粒物组成的透明或半透明团块，内有不规则晶体，而人工麝香和麝香伪品则不具有上述显微特征。

药材的同名异物比较普遍，有的药材本身缺少显著的专属性鉴别特征，进而造成显微鉴定的复杂性[8]。因此显微鉴别法适用于经过初级加工、外形改变或者破碎不易感官判定的中药材。

随着科学技术的发展，传统鉴别手段逐渐向数字化技术发展。

2.2 中药指纹图谱鉴定

中药指纹图谱（fingerprinting）是指某种（或某产地）中药材所共有的、具有特征性的某类或几类成分的色谱或光谱图谱，也包括波谱（质谱-MS和核磁共振谱-NMR）及联用技术。中药指纹图谱可作定性鉴别使用，能以出峰与否及峰高（或峰面积）的比值特异性体现化学成分的有无及相对含量。中药指纹图谱不仅是一种中药质量控制模式和技术，更可以发展成为一种中药作用理论研究和新药开发的模式。

2.2.1 色谱法

包括薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）和高效毛细管电泳（HPCE）等技术方法。

2.2.1.1 TLC

TLC是选用适当展开剂，对药材提取液成分进行分离，选取特征斑点进行中药材鉴别。对中药材进行简单粉碎、消化处理后上色谱柱检测，根据各提取液成分及含量不同对其进行鉴别比对。此法直观性强、重现性好，且操作简单、快速、可靠。其中比较成熟的是牛黄的鉴别，中国药典（2015版）规定天然牛黄TCL测定胆酸含量≥4.0%，胆红素含量≥35.0%。

郭月秋等（2000）[9]对鹿茸片、鹿茸粉和鹿角粉进行TLC鉴别，发现鹿茸蜡片、粉片在与甘氨酸对照品相应位置上均有清晰的斑点，而纱片及骨片此斑点只隐约可见或无，表明鹿茸纱片、骨片不及蜡片、粉片质量好。叶志龙等（2014）[10]应用TLC法对10批岭南特色鹿茸饮片所含的氨基酸类成分进行定性及半定量研究，结果表明饮片与鹿茸片的TLC在相同位置有相同颜色的斑点，但是前者颜色不及后者深，说明鹿茸薄片与鹿茸片的氨基酸类成分基本一致，但含量相对较低。程金友（1999）等[11]采用TLC对穿山甲、羊蹄甲、牛蹄甲、猪蹄甲进行氨基酸比对，发现二者所含成分一致，且含量接近，因此提出可寻求穿山甲的替代品。而李寅超（2008）[12]的研究表明，猪蹄甲确实也具有穿山甲消痈排脓的作用。

2.2.1.2 HPLC

采用HPLC开展中药成分鉴定是最先发展起来的中药化学成分指纹图谱技术，具有很高的分离度，可把复杂的化学成分分离成一系列的色谱峰，这些色谱峰的高度和峰面积分别代表各种不同化学成分和其含量。

HPLC分析在阿胶等中药材的鉴别应用较为广泛。程显隆等（2009）[13]对阿胶水解得到的氨基酸进行衍生化后，采用HPLC法测定L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸4种主要氨基酸的含量，解决了阿胶中人为非法加入含氮化合物的问题。于海英等（2009）[14]采用正己烷-水-氯仿三相静态萃取法制备东阿阿胶、龟甲胶样品中的脂溶性成分，HPLC分析结果显示两种胶间存在着明显的差异。张贵锋等（2009）[15]采用液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）方法对胰蛋白酶作用后的阿胶、牛皮胶及猪皮胶水解物进行分析，证明通过HPLC-MS检测样品胶酶解物的特征多肽可追溯其动物来源。陈萍红等（2013）[16]运用柱前衍生RP-HPLC测定法对阿胶中13种氨基酸的组成及其含量进行了分析，为阿胶的质量控制提供了依据。此外，超高效液相色谱-三重四极杆质谱法已广泛应用于各类中成药中阿胶的检测研究[17]，如阿胶补血颗粒[18，19]、补血益母丸[20]以及复方阿胶浆[21]等。

另外，HPLC在其他中药材的成分分析和质量检测中也较为常用。段志红（2003）[22]建立了熊胆丸中龙胆苦苷的HPLC检测方法，对处方药中龙胆的鉴别具有专属性，故收入修订后的熊胆丸质量标准。杨仕珉等[23]所建立的安宫牛黄丸HPLC指纹图谱方法能够反映安宫牛黄丸中天然牛黄的特征，可鉴别天然牛黄和培植牛黄以及含有天然牛黄和培植牛黄的安宫牛黄丸制剂，可用于安宫牛黄丸的整体质量评价。

2.2.1.3 GC

GC是一种具有分析速度快、分离效率高且分析灵敏度高的分离分析方法，近年来应用比较广泛。高其品等（1993）[24]采用GC检测了鹿茸胶中磷脂酞肌醇、磷脂酞乙醇胺、磷脂酞胆碱、溶血磷脂酞胆碱、神经鞘磷脂的含量，并以此作为评价的指标成分，为鹿茸的质量评价提供了可靠的依据。池舒耀等（2014）[25]建立了顶空气相色谱法检测人工牛黄中的残留溶剂，对人工牛黄的质量检测提供了快速有效的检测手段。张皓冰等（2005）[26]采用GC-MS联用确定了麝香中19种甾体成分的结构并提出了辨别麝香真伪的特征方法。杨弘等（2012）[27]采用GC-MS联用分别对野生国产麝香、进口麝香和家养国产麝香的多组分进行分析，从23个色谱峰中鉴定出了13个化合物，为麝香质量的优劣提供了判断依据。

2.2.1.4 HPCE

HPCE是近年来发展最快的分析方法之一，其以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间滴度和分配行为上的差异而实现液相分离分析。许重远等（2007）[28]采用HPCE法对穿山甲及其炮制品进行电泳分析，发现二者在酸性提取液的HPCE图谱有一定差异，因而可以用于区分。孙绩岩等（2014）[29]采用HPCE与随机扩增多态性DNA标记（HPCE-RAPD）联用技术可用于不同鹿茸样品的快速真伪鉴别。

2.2.2 光谱法

光谱法是基于物质与辐射能作用时，测量由物质内部发生量子化能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。其中，常用于中药材鉴别的光谱法主要有近红外光谱法（NIR）、紫外光谱法（UVS）和X射线衍射光谱法（XRD）等。

2.2.2.1 NIR

近年来，NIR技术以其整体、快速、无损等特点被广泛应用于各个领域，其中包括中药材的鉴别。刘姗姗等（2014）[30]基于显微NIR技术对天然牛黄和人工牛黄进行了鉴别研究，表明显微NIR技术可以有效提取牛黄药材中的多种信息，从而对人工牛黄和天然牛黄进行快速有效的鉴别。李文龙等（2014）[31]建立的NIR可实现对熊胆粉的真伪鉴别，并可对掺伪品中熊胆粉的掺入比例进行定量分析，与传统的熊胆粉鉴别方法相比，具有快速，样品无损、样品信息反映较为完全等优点，并可为其他贵重药材的质量鉴别提供借鉴。毛建江等[32]研究发现采用软件计算样品近红外光谱图之间的欧氏距离，可反映不同鹿茸样品间的差异。

在实际应用中经常将红外光谱法与其他分析技术相结合，对中药材进行区别鉴定。如许长华等（2005）[33]人证实可以采用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）和二维相关红外光谱技术（2D-IR）对伪阿胶、黄明胶和阿胶进行区分。袁丹等（2010）[34]采用FT-IR法测定熊胆粉、牛胆、猪胆和羊胆IR光谱，研究表明动物胆类药材具有IR鉴别特征。唐慧英等（2009）[35]研究采用FT-IR结合二阶导数技术根据特征峰来确定不同等级鹿茸中所含的主要成分，进而快速、准确有效地实现了对不同商品等级鹿茸的品质评价。

2.2.2.2 UVS

采用紫外分光光度法对一些中药材进行真伪鉴别，简便易行、可靠性高、重现性好。张思巨等（1998）[36]采用直接紫外分光光度法进行光谱分析，发现商品阿胶、鹿角胶、龟甲胶的光谱图相似，而自制的鹿角胶、龟甲胶样品与阿胶有较大区别。

将UVS与层析法联用，也可以对部分中药材的品质进行区分。王淑娟等（2010）[5]将薄层层析与紫外联用对穿山甲鳞片混淆品进行色谱分析，发现在色谱Rf值约0.6的位置上缺少一个斑点，说明穿山甲与混淆品有区别。

2.2.2.3 X射线衍射Fourier指纹图谱

吕扬等（2000）[37]在粉末X射线衍射Fourier指纹图谱技术鉴别中药材方面做了大量研究，其中对天然牛黄的研究中获得了天然牛黄X衍射Fourier图谱（几何拓扑图形与特征标记峰值），可用于鉴别正品天然牛黄与人工培植牛黄。张丽等（2005）[38]也应用该技术对1个梅花鹿茸和3个马鹿茸进行分析鉴定，获得了两种鹿茸的X射线衍射Fourier指纹图谱及其特征标记峰值，分析发现两种来源的鹿茸具有共同的组分性质，根据图谱不仅可以鉴别不同种属来源的鹿茸，而且还可以鉴别鹿茸的来源部位（根部、中部或尖部）。大量研究表明，X射线衍射Fourier指纹图谱技术在分析鉴别同种中药材的不同来源方面有着更为广阔的发展前景。

2.3 现代生物鉴定技术

随着分子生物学技术的迅速发展，DNA分子技术越来越多地应用于中药材的鉴别研究，并有准确率高、重复性好等特点。DNA分子技术主要包括DNA条形码技术和PCR扩增技术等。

2.3.1 DNA条形码技术

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码技术是一种对物种进行快速准确鉴定的新兴技术，正在逐步应用于中药材的鉴定。陈士林等（2013）[39]通过对大量中药材样本进行DNA条形码分子鉴定研究，确立了以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。张蓉等（2011）[40]建立的鹿茸药材DNA条形码鉴别方法，可用于正品鹿茸马鹿和梅花鹿及其混伪品的准确鉴定；进而又采用线粒体COI基因，设计了一对鹿类DNA条形码通用引物，结果证明除马鹿、梅花鹿的个别样本外，DNA条形码鉴别方法可有效地鉴定90%的鹿茸样本，包括鹿茸粉[41]。同样贾静等（2014）[42]也利用COI序列作为DNA条形码对药材穿山甲及其混伪品进行鉴定。类似的左华丽等（2014）[43]基于DNA条形码，针对马和驴的线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I设计特异性引物，建立PCR方法，用于鉴别阿胶真伪以及动物皮种溯源。市场上麝香中掺入的伪品，如麝鼠香、鸡血块、羊粪便、猪等组织及分泌物，也可以借助COI条形码进行鉴定区别[44]。

2.3.2 PCR扩增

利用PCR扩增的方法对物种来源进行鉴定在鹿茸方面的研究实例比较多见，如王学勇等（2009）[45]根据鹿科鹿属种动物Cytb全序列比对分析，设计1对特异性引物，能准确鉴别正品鹿茸（包括梅花鹿和马鹿）和其他近源种鹿茸，能鉴别区分正品鹿茸与其他近源种鹿茸药材。涂剑锋等（2009）[46]根据鹿科动物线粒体DNA的Cytb基因序列设计特异性引物1对，可对真伪鹿茸进行鉴别。张敏等（2006）[47]对4种茸鹿的SRY基因进行扩增，从扩增的图象可以准确地对这4种鹿茸进行区别。白根本等（2006）[48]从马鹿、梅花鹿等国内11种鹿的鹿血和鹿茸中提取DNA，用通用引物L1091和H1478调取细胞线粒体12S rRNA基因片段，结果12S rRNA基因片段能较好地在种的水平上将不同的种区分开来，特异引物对（EP-1/H 1478和EP-2/H 1478）PCR可准确地鉴定出马鹿和梅花鹿等。李波等（2006）[49]运用细胞色素b基因（Cytb）和12S核糖体RNA（12S rRNA）基因鉴别梅花鹿和马鹿。

3 展望

中药材在中医临床上有着广泛的应用，药理药用方面的开发研究越来越受到重视。由于珍贵动物药材具有疗效高、活性强、应用广、潜力大的特点，故越来越引起国内外学者的关注。然而市场上动物源性中药材的伪品繁多且复杂，严重影响了药材的质量和市场，以往的质量控制还仅仅停留在传统性状、显微等经验鉴别上，这种状况严重制约了动物类中药材的市场发展，因此改进和提高中药材的鉴别方法非常必要。随着现代生物技术和仪器分析水平的快速发展，动物中药材的质量控制水平也得到了质的提高，可以采用光谱、气/液色谱、质谱以及相关联用技术，研究地道动物源性珍贵中药材的特异性图谱鉴别特征；同时，借助日新月异的谱学技术以及DNA条形码、PCR扩增等新兴分子生物学检测技术，开展特异性功能成分的定性鉴别鉴定乃至定量研究，改进动物中药材标准相对落后的局面，造福食品安全及人类健康。

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Research Progress on the Identification Technology of Animal-Origin Chinese Medicines

WU Shaoliang1，LIU Han2，DENG Junhua2*，FAN Yanru2，LU Xiaomeng3
（1.People’s Hospital of Linshu County，Linshu，Shandong，276700；
2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine；3.Tianjin University of Science&Technology）

To provide research foundation for the scientific distinguishing animal-origin Chinese medicine products from the fakes and inferior products，at the same time，to further protect consumers health，the recent research progress on their physical characterizations，the fingerprinting identification，chromatographic andspectroscopicanalysis，DNAamplification，barcodingandsequencingidentifyingtechnologiesare reviewed in this article.

Animal-Origin Chinese Medicine；Quality；Ingredients；Identification

R282

E-mail：sqwu@sina.com；*通讯作者E-mail：dengqifei-198825@163.com

国家科技支撑计划项目（2012BAK11B04）

2016-12-01