乳制品中黄曲霉毒素M1的常用检测方法比较分析

丁松乔，肖志刚

（1.东北农业大学食品学院,哈尔滨150030；2.黑龙江省质量监督检测研究院,哈尔滨150028）

乳制品中黄曲霉毒素M1的常用检测方法比较分析

丁松乔1，2，肖志刚1

（1.东北农业大学食品学院,哈尔滨150030；2.黑龙江省质量监督检测研究院,哈尔滨150028）

本文介绍了黄曲霉毒素M1的性质、产生、危害、国内外的限量标准以及集中常用的黄曲霉毒素M1的检测方法，并对几种常用的检测方法进行实验结果分析。通过对检出限、灵敏度及回收率等实验结果比较，综合前处理过程的环保安全性、过程繁琐情况及投资成本，提出该几种常用方法的优缺点，分析目前几种方法在检测黄曲霉毒素M1的应用中存在的问题。结合我国目前发展需要和常用检测方法的运用情况，提出将目前常用几种方法互补联用，研究廉价快速的检测试纸是未来工作的重点和今后发展的方向。

黄曲霉毒素M1；危害；限量标准；检测方法；比较

0 引 言

乳制品营养丰富，能够增强人体免疫力，受到很多国家的重视。据统计，我国居民平均每人每年摄入牛奶约8.1 kg，欧美国家人均摄入牛奶300 kg，日本约62.1kg[1]。改革开放以来，我国奶业快速发展，乳品加工成为食品工业中发展最快的行业。但是我们必须重视起快速发展的同时突显的问题。近年来频频爆发乳源性疾病，1999年比利时二恶英污染[2]，2000年日本金黄色葡萄球菌污染[3]，2002年俄罗斯劣质乳制品中毒事件，2003年广东“结核奶”事件[4]，2004年阜阳劣质奶粉事件[5]，由此看来，现有的乳制品安全控制体系仍然不够健全和完善，不能完全的保障乳制品的安全，发展“安全牛奶”成为当前乳制品发展的首要任务。

1 黄曲霉毒素M1的性质、产生及危害

黄曲霉毒素M1的基本结构为二呋喃环的氧杂萘邻酮，分子式为C17H12O7，分子量为328，熔点299℃，形状为无色的长方形片状晶体。在365 nm紫外光的照射下产生蓝紫色荧光。不溶于石油醚，乙醚，正己烷等非极性溶剂，溶于甲醇，氯仿等有机溶剂，化学及物理性质相当稳定，巴氏杀菌不能破坏其理化性质。

乳制品中的黄曲霉毒素主要为黄曲霉毒素M1（A flatoxins M1，AFM1），AFM1是黄曲霉毒素B1（A flatoxins B1，AFB1）的羟化代谢产物。动物在摄入被AFB1污染的饲料后，饲料中的AFB1在肝脏微粒体单氧化酶的催化下，通过细胞色素P-448调节，AFB1末端的呋喃环C-10被羟化而生成AFM1，经过代谢产生的AFM1随乳汁排出[7]。AFM1毒性强，对人体危害大，1993年世界卫生组织WHO将AFM1归为I类致癌物[8]，其毒性是氰化钾的5倍，砒霜的40倍。AFM1具有强致癌性和致基因突变性。AFM1进入人体后，对血液、肝脏、肾脏、肌肉有不同程度的破坏，其中对肝脏和肾脏的危害最大。当与乙肝病毒共同作用于肝脏时形成倍乘风险效应，导致肝癌发生[9,10]。另外，当婴幼儿乳品中含有AFM1时，对婴幼儿健康会造成很大影响，可以造成发育迟缓，肾功能降低，肝细胞癌早发，甚至可能导致急性中毒死亡。

2 国内外限量标准

鉴于AFM1对乳及乳制品的污染，目前世界上包括我国在内的60多个国家和地区制定了乳及乳制品中AFM1的限量和标准。包括中国、美国和日本在内的许多国家规定乳及乳制品中AFM1的质量分数不得超过0.5μg/kg，欧盟制定的标准更为严格，为0.05μg/kg。其中中国规定婴儿乳品及代乳品中AFM1不得检出。2004年，欧盟制定婴儿配方食品的限量标准，AFM1的最大限量为0.025μg/kg。一些主要国家乳制品中的限量标准如表1所示。

表1 主要国家乳及乳制品中AFM1的限量标准

3 乳品中常见的AFM1的检测方法

自1963年A llcroft发现牛奶中含有AFM1以来，对AFM1的检测方法，各国科学家做了大量的研究，建立了30余种检测方法。AFM1的检测方法主要有五大类：一类是定性检测方法，即生物学方法，现已基本停止使用；第二类是半定量检测方法，如薄层色谱法（TLC）；第三类AFM1定量检测方法，包括建立在色谱基础上的理化方法，如液相色谱法（LC）、高效液相色谱法（HPLC）和近年来新发展起来的质谱检测（M ASS）；第四类是建立在免疫化学基础上的快速测定方法，如放射免疫测定（R IA）和酶联免疫测定法（ELISA）；第五类是免疫化学和仪器分析结合的方法，如免疫亲和柱-荧光分光光度法、免疫亲和柱-HPLC法等[11]。

3.1 薄层层析法(TLC)

薄层层析法又称薄层色谱，是色谱法中的一种，是快速分离定性分析或半定量分析少量物质的检测方法。1990年美国分析化学家协会（AOAC）将薄层层析法（TLC）定为标准方法。该种方法样品经提取、浓缩、薄层分离，AFM1经波长365 nm的紫外光产生蓝紫色荧光，根据其在薄板上显示的荧光最低检出量与标准溶液的荧光强度比较测定强度。

黄曲霉毒素M1用氯仿萃取，挥去氯仿，加入四氯化碳和氯化钠-甲醇溶液于残渣中，再用氯仿提取，最后用薄层层析法定量检测。奶粉中黄曲霉毒素M1的检出限为0.5μg/kg，该方法用1∶3硫酸显色后检出限可提高为0.3μg/kg。以空白样品为标准，进行3种质量分数0.5，2.0，10.0μg/kg的回收率实验，结果平均回收率可达到85.6%～98.6%，标准偏差为11%，符合实验要求。

由于薄层层析法不依赖仪器、成本低并且易于普及，20世纪60年代是国内外检测AFM1的主要方法，常在检出限较低的情况下使用。但是，由于该方法在婴幼儿乳品AFM1检测时灵敏性和重现性较差，且检出限无法满足国家规定的限量要求，逐渐被更灵敏高效的方法取代。

3.2 免疫亲和柱法

20世纪90年代，分析领域得到一种具备高专一性吸附和抗干扰特性，灵敏度高，净化效果好的新技术-免疫亲和柱法。在乳粉试样中分别加入水和盐制成复原乳，离心使脂肪与AFM1乳清分离。吸取上清液，过滤，通过免疫亲和柱，使AFM1与专一抗体结合。用洗涤液去除免疫亲和柱中的杂质，用甲醇过柱，使AFM1与抗体分离洗脱。甲醇洗脱液中加入显色剂后以荧光分析仪测定，检测低限为≤0.1μg/kg。

3.2.1 实验分析

在定容到50 mL的未检出黄曲霉毒素M1样品中分别添加质量分数为0，0.1，0.5，1.0μg/kg的黄曲霉毒素M1，进行回收率检测，其结果如表2所示。

表2 奶粉及液乳样品添加回收率实验结果

通过以上实验结果，该种方法检测乳制品中AM F1在0.1～1μg/kg浓度范围内，平均回收率为89.6%～96.0%，CV变异系数为0.52%～5.8%，满足国家标准检测要求。根据检测，免疫亲和柱法检出限为0.1μg/kg，低于国家标准0.5μg/kg。

Scott[12]也使用此方法，用免疫亲和柱分离样品，利用荧光光度计检测牛乳中的AFM1，检出限为0.05μg/L，平均回收率可达到97%。此方法显著简化了样品的前处理过程，无需使用标准物质AFM1，降低实验过程中对操作者潜在的危害，但整体操作较繁杂，耗时长，且存在试剂浪费和污染环境的不足，使该方法的应用推广受到一定限制。

3.3高效液相色谱法(HPLC)

目前国内外检测AFM1应用最广泛的方法是高效液相色谱法（HPLC）[13]。其原理是样品经过固定比例的有机溶剂萃取后，经装有相应填料的净化柱去除杂质，样品经净化处理后再进行浓缩干燥，弱酸条件下衍生，最后经过反向C 18柱分离，检测器定量检测。取样品10 g，用水将其溶解并定容至100mL，离心，取上清液通过免疫亲和柱，用1 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，定容至2 mL，混匀后用高效液相色谱仪进行分析。此方法以甲醇和水为流动相，柱温30℃，流速0.8 mL/min；荧光检测器发射波长435 nm，激发波长为365 nm，进样体积为50μL。

3.3.1 实验分析

向黄曲霉毒素M1本底值未检出的乳粉样品中分别添加质量分数为0.5，1.0，2.0μg/kg的黄曲霉毒素M 1，进行回收率检测，结果如表3所示。

表3 HPLC法测定乳粉中黄曲霉毒素M1的实验结果

根据以上结果分析，回收率为91.2%～106.4%，乳粉中黄曲霉毒素M1的最低检出限可达0.04μg/kg。

取黄曲霉毒素M1真值为0.085μg/kg的阳性奶粉标准物质30 g，一式3份平行样，用该种方法进行检测分析，结果分别为0.0812，0.0837，0.0841μg/kg，3次结果均在允许范围内，与真值相近。

通过采用HPLC法进行检测分析，该方法具有高效、灵敏、快速、准确、检出限低、特异性强及重现性好等优点，但是样品处理繁琐（前处理会造成AFM 1损失）、净化柱消耗大、检测成本较高，同时对操作者的专业素养要求较高。

3.4 酶联免疫吸附法（ELISA）

1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn，荷兰学者Uan Weerman和Schuurs分别报道了将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，最初主要用于病毒的检测，70年代中后期开始用于真菌毒素的检测。取适量鲜乳，称取2 kg离心5 min，去除脂肪，取上清液用于检测。向微孔中加入200μL样品和标准品，室温2 h，除去微孔中的内容物，用缓冲液洗涤微孔3次，轻拍微孔板，弃去残留液。加入100μL酶标物于微孔中，室温15 min，洗涤微孔；加入100μL底物于微孔中，室温15min；添加100μL终止液，使用酶标仪在450 nm下记录每个微孔的OD值，根据对应的黄曲霉毒素M1浓度值绘制曲线。

3.4.1 实验分析

向未检出样品中添加黄曲霉毒素M1标准溶液0.25，0.50，1.0，2.0，5.0μg/kg，分别进行回收率测定，每个浓度进行3个平行样品测定，结果如表4所示。

表4 ELISA法测定乳粉中黄曲霉M1的实验结果

根据以上数据分析，样品添加黄曲霉毒素M1的平均回收率为90.0%～107.0%，可见此方法对于测定鲜乳中黄曲霉毒素M1质量分数的稳定性好，结果可靠。目前利用酶联免疫吸附法（ELISA）对AFM1进行检测已得到广泛应用，该方法样品处理简单，结果准确稳定，特异性强，干扰小，方便快捷，灵敏度高且检测成本较低，但由于酶本身具有不稳定性，可能出现少量的假阳性，会对检测结果造成一定的影响。

4 检测结果对照

以上4种检测方法是当前国内外检测分析乳及乳制品中AFM1最常用的方法，各自的特点如表5所示。

表5 4种检测方法分析比较

5 结果与讨论

综上所述，样品前处理过程中需要提取净化的方法，操作复杂，时间较长，劳动强度大。TLC的样品前处理繁琐，灵敏度较差，特异性差，回收率较低，样品的污染性较高；免疫亲和柱的特异性较好，但是需要两种方法的结合才能定量检测，检测成本和技术要求较高；HPLC所需要的检测成本高，净化柱消耗较多，所需要的仪器设备昂贵，投资大，对人员的操作技术要求高；ELISA法相对来说，使用简便，操作快捷，污染程度小，特异性强，灵敏度也高，适用于大批量样品的筛选及检验，成本较低，适合缺乏大型仪器设备的实验室。此外，上述方法都具有相同的不足之处：对样品进行前处理时需要接触有毒、有害的有机试剂，危害实验人员健康且污染环境；操作过程繁琐、时间长；检测方法灵敏度有限，不能满足欧盟的限量要求，由于当前ELISA主要针对鲜乳进行检测，添加复杂成分的婴幼儿配方乳粉依旧使用检测鲜乳的处理方法势必造成结果偏差。

乳及乳制品的品种越来越多样化，在我国的消费量也越来越大。为了确保乳制品市场上的食品质量安全，乳制品中AFM1的检测尤为重要。常用的分析检测方法需在应用中不断的改进和完善，克服自身的弊端。全世界也都在努力建立和完善一套过程完整、有效快速、价格低廉的AFM1分析检测方法。各种方法的互补联用，廉价快速的检测试纸是未来工作的重点和今后发展的方向。

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Dairy products commonly used detection method of Aflatoxin M1in comparative analysis

DING Song-qiao1、2，XIAO Zhi-gang

(1.Northeast Agricultural University,Resources and Environmental Sciences,Harbin 150030,China;2.The Longjiang environmental Group Co.,Ltd.,Harbin 150056,China)

This paper introduces the harm of Aflatoxin M1and AFM1limits,both at home and abroad,and several common methods used for the detection of Aflatoxin M1,and be analyzed the experimental results of the above methods are analyzed.By comparing the detection limit, sensitivity and recovery,environmental safety,process complexity and investment cost of integrated pre process,the advantages and disadvantages of several common methods are proposed，analyzing the problems existing in these methods.According to China's current development needs and common test methods of application,is proposed to be the focus of future work and the direction of development in the future,is the study of a can combine the advantages of several current method,and the price is cheap,fast detection speed new method.

AflatoxinsM1,harm,limit standard,detection method,contrast

TS252.7

B

1001-2230（2016）05-0036-04

2015-09-30

丁松乔（1986-），男，助理工程师，从事食品检验工作。