高速逆流色谱法分离纯化新疆圆柏枝叶中的黄酮类成分

李 倩,李晨阳,买吾拉江·阿不都热衣木,徐 芳,赵 军,*

(1.新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046;2.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室,新疆乌鲁木齐 830004)



高速逆流色谱法分离纯化新疆圆柏枝叶中的黄酮类成分

李 倩1,李晨阳2,买吾拉江·阿不都热衣木1,徐 芳2,赵 军2,*

(1.新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046;2.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室,新疆乌鲁木齐 830004)

目的:建立高速逆流色谱分离纯化新疆圆柏枝叶中的黄酮类成分的方法。方法:以氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.5∶2)为溶剂系统,上相为固定相,下相为流动相,在流速2.0 mL/min、转速850 r/min、检测波长254 nm的条件下,对新疆圆柏中的黄酮类成分进行分离纯化。结果:从新疆圆柏提取物中分离纯化得到3个化合物:异槲皮苷(a,91.89%)、槲皮苷(b,98.45%)、槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(c,95.35%),其中c为首次从圆柏属植物中分离得到的化合物。结论:该法快速简便,能够高效分离新疆圆柏中的黄酮类成分。

高速逆流色谱,新疆圆柏,黄酮,分离

新疆圆柏(JuniperussabinaL.),又名叉子圆柏、砂地柏和臭柏等,为柏科圆柏属常绿匍匐灌木,广泛分布于我国新疆、甘肃、内蒙和陕北的干旱荒山和沙地之中[1]。新疆圆柏枝叶在我国民间常用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎等疾病的治疗,被收载于《维吾尔药志》、《新疆中草药手册》和《中国沙漠药用植物》等医药文献中。该植物包含黄酮、木脂素和萜类等多种类型的化学成分,其中黄酮类化合物是其主要化合物之一[2-5]。

高速逆流色谱(high-speed counter-current chromatography,HSCCC)是近10年迅速发展起来的新型液-液分配色谱技术。与其他分离手段相比,HSCCC不用固相载体作固定相,并具有分离纯度高、样品回收率高、适用范围广、能够同时纯化出多个单体化合物等优点,在医药[6]、天然产物化学[7]、食品[8]等领域有广泛的应用。因此,本实验运用HSCCC从新疆圆柏枝叶中分离黄酮类成分,以期得到分离黄酮的快速简便方法,为进一步药理药效研究和新药的研制提供物质基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新疆圆柏 于2014年9月采自乌鲁木齐后峡地区,由新疆药物研究所何江副研究员鉴定;对照品异槲皮苷(批号MUST-15070211)、槲皮苷(批号MUST-13022112) 成都曼思特生物科技有限公司(纯度均大于98%);D101大孔吸附树脂 天津兴南允能高分子技术有限公司;100～200目柱层层析硅胶 青岛海洋化工厂分厂;60～90目柱层析聚酰胺 中国医药集团上海化学试剂公司;甲醇与乙腈 为色谱纯,美国Fisher公司;水 为纯净水;其余试剂为 国产分析纯。

AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;TBE-300A高速逆流色谱仪 上海同田生化技术有限公司;N2000色谱工作站 浙江大学智达信息工程有限公司;LC-10ATvp高效液相色谱仪、UV-2501PC紫外可见分光光度计、SPD-10Avp紫外可见检测器 日本岛津有限公司;AS系列超声波清洗机 天津奥特赛恩斯仪器有限公司;INOVA-400型超导核磁共振仪 美国VARIAN公司;RT-3型熔点测定仪 天津新天光分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 新疆圆柏总黄酮的制备 取新疆圆柏枝叶样品1 kg,以料液比1∶7(g/mL)加入50%乙醇,回流提取3次,每次提取1.5 h,过滤,合并滤液,减压浓缩至膏状。然后以适量硅胶拌样后上硅胶柱,分别用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)、石油醚∶乙酸乙酯(2∶8)、60%乙醇洗脱。收集60%乙醇洗脱液,减压浓缩至无乙醇味后,再用蒸馏水溶解制成样品溶液。然后上D101大孔树脂柱,收集50%乙醇洗脱液,减压浓缩至干[9]。接着上聚酰胺柱,分别用水、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱,收集50%乙醇洗脱液,50 ℃下减压浓缩至干,用于高速逆流色谱分离。

1.2.2 溶剂体系的选择 选择两相溶剂系统是通过目标化合物的分配系数K来确定的。K值通过HPLC检测确定,步骤如下:取大约5 mg样品放入试管中,加入已平衡的两相溶剂系统,上、下相溶剂各5.0 mL,充分振摇溶解后静置分层,分别取上、下相4 mL旋蒸干,用甲醇溶解定容至10 mL,用HPLC检测,上相和下相的峰面积分别为A1和A2,分配系数K=A1/A2。

1.2.3 HSCCC分离过程 溶剂系统:将氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(1200 mL∶900 mL∶150 mL∶600 mL,即4∶3∶0.5∶2)加入分液漏斗中,充分振摇后静置过夜。实验前将分配平衡的两相溶剂系统按上相和下相分开放入瓶中,超声脱气20 min,以备使用。操作步骤:首先将两相溶剂系统中已超声脱气后的上相(固定相)以10 mL/min泵入HSCCC螺旋管中,待螺旋管充满后,缓慢调节主机转数至850 r/min,顺时针旋转,同时将下相(流动相)以2.0 mL/min泵入其中,待两相平衡后,取样品200 mg溶于5 mL上相和5 mL下相溶液,由进样阀注入到螺旋管中,同时开始采集数据,通过紫外检测器(254 nm)检测流出物,按照色谱图手动收集各成分。保留率计算公式如下：

保留率(%)=(V总-V出)/(V总-V环)×100

式中V总为管路总体积;V出为流动相推出固定相体积;V环为进样环体积(20 mL)。

1.2.4 高效液相色谱(HPLC)分析 采用HPLC检测新疆圆柏总黄酮的成分及经HSCCC分离后各色谱峰的纯度。HPLC分析条件:Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈(A):0.2%磷酸水溶液(B);梯度洗脱程序(0 min～2 min～20 min～25 min,19% A～20% A～24% A～19% A);柱温30 ℃;流速1.0 mL/min;检测波长254 nm;进样量10 μL。

2 结果与分析

2.1 HSCCC分离溶剂系统的选择

溶剂系统是决定HSCCC分离效果的最重要因素,应该满足以下几方面的要求:a.不造成样品的分解与变性;b.足够高的样品溶解度;c.样品在系统中有合适的分配系数值;d.固定相能实现足够高的保留。结合所分离样品的极性偏大,选用极性较大的溶剂系统进行研究。本研究采用HPLC测定,共考察了以下几个溶剂系统,结果见表1。

表1 化合物在不同溶剂系统中的分配系数

K值越大,化合物在固定相中分配越高,导致分离的时间过长,影响分离效率;K值越小,出峰越快,分离效果差。从表1可以看出,溶剂系统K值比较符合条件的是正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(0.5%乙酸)(0.5∶5∶1∶5)和氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.5∶2),但是溶剂系统正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(0.5%乙酸)(0.5∶5∶1∶5)的b、c化合物的K值比较接近,分离度小,无法将它们分开。因此,选择溶剂系统为氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.5∶2),其固定相保留率为73.3%。

2.2 HSCCC分离纯化的结果

根据HSCCC色谱图手动收集,得到3种化合物,分离情况见图1。新疆圆柏总黄酮(200 mg)HSCCC分离得a(24.6 mg),b(54.6 mg)和c(26.8 mg)三个主要组分。

图1 新疆圆柏总黄酮的高速逆流色谱图Fig.1 HSCCC profiles of total flavonoidsfrom Juniperus sabina L

2.3 结构鉴定

峰a和b通过TLC和HPLC检测,并和对照品相对照,鉴定为异槲皮苷和槲皮苷。

峰c为淡黄色粉末,熔点:207～209 ℃,10%硫酸-乙醇溶液显色呈黄色,遇1%三氯化铁-乙醇溶液显色呈黄绿色,UV(MeOH):254 nm,361 nm;1HNMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:6.19(1H,d,J=1.6 Hz,H-6),6.41(1H,d,J=1.6 Hz,H-8),7.52(1H,s,H-2′),6.82(1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),7.53(1H,d,J=6.8 Hz,H-6′),δ5.37(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″).13C-NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:156.7(C-2),133.1(C-3),177.5(C-4),161.4(C-5),98.9(C-6),164.4(C-7),93.7(C-7),156.5(C-9),104.0(C-10),121.7(C-l′),115.3(C-2′),145.0(C-3′),148.7(C-4′),116.3(C-5′),121.2(C-6′),101.2(C-1″),74.2(C-2″),76.4(C-3″),69.8(C-4″),74.2(C-5″),63.0(C-5″),170.0(>C=O),20.3(CH3)。以上理化性质和波谱数据与文献[10]报道一致,故鉴定该化合物为槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.4 纯度检测

新疆圆柏总黄酮的HPLC色谱图见图2。经HSCCC分离所得主要峰通过HPLC检验(图3),用峰面积归一法计算纯度。

图2 新疆圆柏总黄酮的HPLC色谱图Fig.2 HPLC profiles of total flavonoidsfrom Juniperus sabina L

图3 HSCCC中3个组分的HPLC色谱图Fig.3 HPLC profiles of three components in HSCCC

HPLC检测结果表明,峰a是异槲皮苷,纯度为91.89%;峰b是槲皮苷,纯度为98.45%;峰c是槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷,纯度为95.35%。从结果可知,HSCCC高效、快速、连续地从新疆圆柏总黄酮中分离得到3种主要的黄酮类化合物。新疆圆柏总黄酮种类多、结果复杂,通过其他方法纯化比较复杂,而采用HSCCC方法操作方便、分离时间短、样品回收率高,同时制备成本较低、重现性好,一步分离得到新疆圆柏总黄酮中3种主要的黄酮类化合物,这为高速逆流色谱技术在药物工业中的应用奠定了坚实的物质基础和技术基础。

3 结论

应用高速逆流色谱分离新疆圆柏总黄酮,得到3种黄酮类化合物,纯度均大于90%。经结构表征,分别确定为:异槲皮苷(91.89%)、槲皮苷(98.45%)、槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(95.35%),其中化合物c为首次从圆柏属植物中分离得到的成分。由于HSCCC不用固态载体做固定相,避免了载体填充物所形成的不可逆吸附、减少了样品的损耗、分离时间短、回收率高、分离效率高,能实现更有效的制备性分离和纯化,可用于新疆圆柏中黄酮类成分的快速分离。

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Separation and purification of flavonoids fromJuniperussabinaL. by high-speed counter-current chromatography

LI Qian1,LI Chen-yang2,Maiwulajiang ABUDUREYIMU1,XU Fang2,ZHAO Jun2,*

(1.College of Life Sciences&Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China; 2.Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines,Xinjiang Institute of Materia Medica,Urumqi 830004,China)

Objective:To study separation and purification of flavonoids from the leaves ofJuniperussabinaL. by high-speed counter-current chromatography(HSCCC). Methods:Solvent system of chloroform∶methanol∶n-butanol∶water(4∶3∶0.5∶2)was employed,the upper phase as stationary phase,the lower phase as mobile phase,a flow-rate of 2.0 mL/min,the rotation speed 850 r/min and detection wavelength 254 nm,flavonoids fromJuniperussabinaL. were isolated and purified under this condition. Results:Three compounds were separated from the leaves ofJuniperussabinaL. as isoquercitrin(a,91.89%),quercitrin(b,98.45%),quercetin-3-O-(6″-O-acetyl)-β-D-glucopyranoside(c,95.35%),of which compound c was separated fromJuniperusgenusfor the first time. Conclusion:This method could conveniently and effectively separate flavonoids fromJuniperussabinaL.

high-speed counter-current chromatography;JuniperussabinaL.;flavonoids;separation

2016-05-20

李倩(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：药食兼用植物的研究与开发，E-mail：yaaitingzheng@163.com。

*通讯作者:赵军(1973-)，男，博士，研究员，研究方向：中药与天然药物化学研究，E-mail:zhaojun21cn@163.com。

新疆维吾尔自治区科技支撑计划(201433103)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)22-0059-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.003